24.+Apoptosis

La muerte celular es un proceso natural, común e importante en el desarrollo y en la vida adulta de los organismos multicelulares. Sin embargo, los tejidos y los organismos no sufren o se encogen porque la constante división celular balancea exactamente el proceso de muerte celular. Este “proceso” cuando es mediado por pasos específicos intracelulares se llama programa de muerte celular porque es una manera controlada en que la célula muere. La muerte celular puede ser provocada por lesiones sostenidas por la célula o por el suicidio de la célula. Usualmente las lesiones son causadas por daños mecánicos o por exposición a sustancias tóxicas. En este caso la muerte ocurre porque las células activan un proceso llamado necrosis celular, que no es una forma del programa de muerte celular. En segunda instancia, el suicidio celular es mediado por un proceso llamado apoptosis el cual tiene trayectos intrínsicos (mediados por señales intracelulares, [mitocondria] ) y extrínsecos (mediados por señales extracelulares activacion de proteinas caspasas ejecutoras ).

Apostosis: Involucra célula, la célula se encoje, requiere ATP, se forman burbujas que salen de la membrana (blebs), Insulto: daño en el DNA durante el ciclo celular, ausencia de factores de crecimiento o nutrientes.En experimientos in vivo: se observa un patron de escalera de DNA. Necrosis: Involucra el tejido, la célula se hincha y se rompe, No requiere ATP. Hay lisis celular, produce inflamación, enrojecimiento y área caliente. El insulto es traumático. En experimientos in vivo: se puede ver la cromatina regada

El apoptosis es uno de los métodos del programa de muerte celular y el misma desencadena una cascada de señales que concluye con la muerte de la célula. Se caracteriza por ser limpio (no afecta los tejidos cercanos), recogido (no permanecen remanentes de la célula) y dependiente de Caspasa. Apoptosis ocurre mayormente en animales, pero se ha observado en plantas (senescencia de flores y hojas y respuesta a infección y daño) y organismos unicelulares (bacteria y levaduras).

Este proceso se estudió inicialmente en el organismo //C. Elegans// porque (a) el mismo tiene un epitelio transparente que permitía observar claramente los procesos celulares y (b) se conocía el linaje de las células del organismo.



Hay una gran cantidad de células que mueren a causa de apoptosis lo que indica que este mecanismo debe ser responsable de un sinnúmero de procesos en la célula. El apoptosis tiene funciones importantes en el desarrollo y en las etapas adultas de los organismos. Éste esculpe estructuras tempranas (elimina células en las membranas interdigitales para el desarrollo apropiado de los dígitos) y elimina estructuras innecesarias (la cola del renacuajo se elimina al ocurrir la transición a rana).



Apoptosis también se ocupa de eliminar más de la mitad de células nerviosas durante el desarrollo del sistema nervioso, muchas veces para lograr el apareo adecuado con células “target”.
 * Puntos verdes en la cola del renacuajo son núcleos llevando acabo apoptosis.

En los adultos, este mecanismo es responsable de lograr un balance saludable de células (nacimiento = muerte). De hecho, la pérdida de balance celular puede resultar en varios desórdenes que pueden afectar el funcionamiento normal del organismo. Algunos desórdenes incluyen: enfermedades neurodegenerativas, daño isquémico (daños a tejidos causado por restricciones al flujo de sangre), enfermedades autoinmunes y cáncer.

Otra función general de este mecanismo es el control de calidad de las células, sea en el desarrollo o en las células adultas, ya que elimina células anormales, no-funcionales (células con daños al DNA, por ejemplo), dañinas (células infectadas por virases) y extraviadas.

Las células que están llevando acabo apoptosis se pueden identificar a través de los cambios morfológicos y bioquímicos que se pueden observan en ellas. Mediante un microscopio se puede observar que las células apoptóticas se encogen y se condensan, el citoesqueleto colapsa, la envoltura nuclear se desmantela y la cromatina nuclear se condensa y se fragmenta. Adicionalmente, la superficie “blebs” (se ampolla) y, si la célula es grande, se puede romper en fragmentos cubiertos por membrana llamados cuerpos apoptóticos.

// Fig. 1. // Apoptosis and autophagy in bovine mammary gland a) The cell with a morphology characteristic for late stage of apoptosis: shrinkage of cell, aggregation of organelles in perinuclear area with amorphous cytoplasm on the peripheral area, high condensation of chromatin in nucleus and intact plasma membrane of the cell. Bar = 1 µm b) The dying cell forming apoptotic bodies (AP). Bar = 1 µm c) Autophagy in mammary gland; Early stage of autophagy is represented by disorganization of cytoskeletal elements. The filaments form multilamellar structures (arrows). Almost all mitochondria are swollen. The polygonal nucleus posses condensed chromatin (CHR). Nuclear envelope and plasma membrane are intact. Bar = 500 nm

d) Late stage of autophagy in mammary gland; Note typical concentration of chromatin (CHR) in the center of round nucleus. In cytoplasm abundant degradative autophagic vacuoles (arrows). The cytoplasmic organelles are still ultrastructurally unchanged. Scanty filaments of cytoskeleton in cytoplasm are present. Bar = 1 µm

Las células que llevan a cabo la apoptosis no solamente tiene características morfológicas también se puede determinar si una célula es apoptótica utilizando algunos marcadores bioquímicos y técnicas de laboratorio. Utilizando “gel electrophoresis”, por ejemplo, se pueden identificar el patrón escalera que forma el ADN cuando, durante apoptosis, la endonucleasa rompe ADN cromosomal en tamaños distintivos. Esto ocurre porque la endonucleasa elige específicamente zonas de enlace (“linker regions”) entre los nucleosomas para romper. Más aún, cuando se rompe el ADN, los fragmentos generan terminaciones que se pueden marcar utilizando la técnica TUNEL. Esta técnica añade un nucleótido etiquetado a la terminación OH. El cell-surface phosphatidylserine es un marcador conveniente para apoptosis. Ayuda a la señal de las celulas vecinas y macrófagos para fagocitar la celula que va a morir. Además de enviar señal al macrófago bloquea la respuesta inflamatoria del sistema inmunológico.


 * La apostosis depende de una cascada intracelular proteolitica mediada por caspasas**

La apostosis necesita proteasas que tienen una cisteina en su sitio activo y parte sus proteínas blanco en acidos asparticos especificos. Las caspasas están sintetizadas en la celula como precursores inactivos (procaspasas), se activan por el rompimiento proteolitico. Las caspasas tienen la siguiente estructura general:

__Prodominios|Subunidad grande| SubUnidad Pequeña__


 * Activación de la procreasa durante apoptosis**
 * En la parte A de la figura, están las dos procaspasas (porque están en estado inactivo). Para activarse necesitan romperse y para esto utilizan una capasa activa, que propicia la separacion de los prodominios y el cambio de conformación de las subunidades. El resultado de esto es una capasa activa.
 * En la parte B de la figura indica que la primera procaspasa activada se le conoce como procaspasa iniciadora, la cual se rompe y activa varias procaspasas ejecutorias produciendo una amplia reacción en cadena. Las ejecutorias, luego parten una variedad de proteinas claves en la celula incluyendo proteinas citosolicas especificas y laminas nucleales, promoviendo la muerte celular controlada. (Proteinas blancos pueden ser endonucleasas en su forma inactiva, componentes del citoesqueleto, y proteinas de adhesion célula-célula.

La cascada de caspasa no es solo destructivo tambien es irreversible. La caspasa requerida depende del tipo de célula y del estímulo.

Las procaspasas iniciadoras tienen un prodominio largo el cual contiene un dominio de reclutamiento de caspasa (CARD)[caspase recriutment domain] que les permite ensamblarse con las proteínas adaptadoras en los complejos de activacion cuando la célula recibe la señal, comienza la apoptosis.
 * ¿Cómo se activa la primera cascada de caspasa?**

Caspasas iniciadoras: [humanos] 2,8,9,10 Caspasa ejecutotrias: [humanos] 3,6,7


 * Trayectoria Extrínseca**


 * Receptores de muerte:** proteínas transmembranales que contienen un dominio "ligand-binding" __extracelular__. Un dominio transmembranal sencillo= dominio de muerte, el cual es necesario para los receptores con el fin de activar el programa apoptótico.


 * Cascada:**




 * Comienza con la activación de Fas death receptor en la superficie de la célula blanco por el ligando Fas en la superficie del linfocito asesino (citotóxico).
 * Los dominios de muerte en las colas de los receptores de muerte Fas recluta las proteínas adaptadoras las cuales reclutan las procaspasas iniciadoras (proscapasa-8, proscapasa-10 o ambas) formando un complejo de señal de muerte inducida (DISC = death-inducing signalind complex).
 * Una vez el DISC activado, las caspasas iniciadoras activan la cadena downstream de proscapasas ejecutorias que vimos en la figura anterior.

Muchas células producen proteínas inhibitorias que pueden actuar intra o extracelularmente. Estas dominan el pathway extrínsico y previenen la activación inapropiada de trayectoria extrínsica.
 * Los receptores decoy: tienen un dominio de "ligand-binding" pero no un dominio de muerte. Pueden enlazar el ligando de muerte pero no llevar a cabo apoptosis.Estos inhiben los receptores de muerte.
 * FLIP: proteínas intracelulares bloqueadoras. Parecidas a las proscapasas inciadoras pero no tienen dominio proteolítico.


 * Trayectoria Intrínseca**


 * Depende de Mitocondria.
 * Se activa la apoptosis desde el __interior__ de la célula como respuesta a un insulto [daño en el DNA, falta de oxígeno, nutrientes, o señales se sobrevivencia extracelular].
 * Depende de la liberación hacia el citosol de proteínas mitocondriales que normalmente residen en el espacio intermembranal.
 * Algunas de las proteínas liberadas activan la cascada proteolítica en el citoplasma, haciendo que surja la apoptosis. Un ejemplo es citocromo c: un componente de la cadena de transpote mitocondrial, soluble en agua. Cuando es liberada al citosol se enlaza a las proteínas adaptadoras que activan proscapasa o sea a Apaf1 (apoptotic protease activating factor1) causando que esta última se oligomerice formando un apoptosoma. Luego las proteínas Apaf1 en el apoptosoma reclutan a las proteínas proscapasas iniciadoras (proscapasa 9).
 * La trayectoria intrinseca de apoptosis**
 * Mitocondria libera citocromo C por un estimulo apoptótico. Al interacuar con Apaf1, esta cambia de conformación, exhibiendo el CARD domain y aceptando el enlace de citocromo C. Para esto se requirió hidrólisis de dATP a dADP.
 * Una vez el CARD domain dentro del Aparf1 y como consecuencia el dominio CARD expuesto. Se forma la figura del apostosoma gatillada por la liberación de dADP en intercambio para dATP.
 * Este complejo recluta y activan procaspasa-9 que se une al apostosoma porque tambien posee un CARD Domain.
 * Se rompe caspasa-9 y activa a las proscapasas ejecutoras.
 * Se inicia la cascada que guia hacia la apoptosis.


 * Proteínas Bcl2:**

En algunas células la trayectoria extrínseca debe reclutar la intrínseca para ampliar la señal apoptótica para matar la célula. Para esto activa un miembro de la familia de proteínas Bcl2. En los mamíferos, estas proteínas regulan la trayectoria intrinseca de apoptosis controlando la liberación de citocromo c y otras proteínas mitocóndricas intermembranales al citosol. Algunas proteínas Bcl2 son pro-apoptoticas y promueven la apoptosis aumentando la liberacion, mientras que otras son anti-apoptoticas las cuales inhiben la apoptosis bloqueando la liberación. Las pro-apoptóticas consisten de dos subfamilias:
 * BH123: Proteínas Bax(citosol) y Bak(membrana externa del mitocondrias) similares estructuralmente a Blc2 pero no tienen el dominio BH4. Cuando el estimulo apoptotico estimula la trayectoria intrínseca, estas se activan ( o al menos una de estas) y se agregan para formar oligomeros en la membrana externa mitocondrial, induciendo la liberación de citocromo c. La activación de estas proteínas usualmente dependen de BH3-only protein activada. Tambien, estas proteinas se encuentran en la superficie del ER y membranas nucleales donde liberan Ca+2
 * BH3-only protein. Solo comparte homología con Blc2 en el dominio BH3


 * Inhibidores de Apoptosis**

Los **Inhibidores de Apoptosis (IAPs)** son proteínas hechas en la gran mayoría de células animales para prevenir a la célula de asesinarse a ella misma por medio de apoptosis. Estas proteínas tienen uno o más dominios llamados BIR (Baculovirus IAP repeat) -//nombre que se le dio porque se identificaron por primera vez en ciertos viruses de insectos llamados baculoviruses//-, lo que hace que se enlacen a las caspasas ya activadas, inhibiendo sus funciones. Algunas IAPs también poliubiquitilan las caspasas, marcándoles su destino de destrucción por los proteosomas. De esta manera, los IAPs se convierten en un impedimento para la acción apoptótica de las caspasas.

En la mosca //Drosophila// se han podido obserbar proteínas neutralizadoras de los IAPs, llamadas **anti-IAPs**, convirtiéndose así en proteínas que promueven la Apoptosis. En la //Drosophila// hay cinco de ellas, y este grupo incluye a //Reaper, Grim,// y //Hid//. En lo unico que se asemejan estas tres es que tienen un terminal-//N// corto que se enlaza a los dominios BIR de los IAPs, inhibiendo así los inhibidores de las caspasas. Este balance entre IAPs y anti IAPs, como pudimos apreciar, es importante en la regulación de apoptosis en la mosca.

En los mamíferos, el rol de los anti-IAPs es más controversial. Los anti-IAPs logran salir del espacio intermembranal de la mitocondria bajo el mismo trayecto en que lo hace el citocroma c, por el intrínseco. Cuando salen, son un complemento para la apoptosis, en el hecho de que citocroma c activa la formación del complejo del apoptosoma que activa la caspasa ejecutoria, y a su vez, los anti-IAPs bloquean los inhibidores de caspasas (los IAPs), promoviendo más la apoptosis. Dos ejemplos que se conocen en los mamíferos son //Omi// y //Smac/DIABLO,// y lo interesante y controversial es que se ha visto que cuando incativadas en células de ratones, apoptosis no se ve afectada.