21.++Ciclo+Celular+(17+de+noviembre)

El ciclo celular incluye desde que nace una célula hasta que la misma se divida para producir dos células hijas. Cuando se comenzó a estudiar la celula, se desarrolló la Teoría celular, la cual dice que las células solamente se originan de otras células pre-existentes. Esta teoría comenzó se desarrolló mucho antes del descubrimiento del microscopio. Interesantemente, fue a través del estudio y observación de células que se comportaban anormalmente (e.g. células cancerosas o mutantes) que se pudo estudiar el ciclo celular en las células normales. Células cancerosas se dividen rápidamente y pues el estudio de división celular en ellas es ideal. Por otro lado, células mutantes pueden ser estudiadas para ver qué efecto tiene una mutación sobre una proteína en el ciclo celular. También, el uso de células madres ha ayudado a entender el proceso del ciclo celular, especialmente en la diferenciación de células y su salida del ciclo celular.


 * Organismos modelos**
 * Levadura
 * //Saccharomyces cerevisiae// (“budding yeast”)
 * ­Schizosaccharomyces //pombe// (“fission yeast”)
 * Mosca: //Drosophila melanogaster//
 * Nematodo: //Caenorhabditis elegans//
 * Ratón: //Mus musculus//
 * Rana africana: //Xenopus laevis//

Para que una célula pueda crecer en un cultivo, la misma necesita de unos componentes o nutrientes necesario. Una celula extraida de tejidos de organismos adultos; como por ejemplo fibroblastos (celulas del tejido conectivo), continuara dividiendose una vez extraida de siu medio original siempre y cuando se encuentre en unas condiciones ambientales adecuada. Las divisiones del ciclo celular ocurre en un tiempo dado, aproximadamente unas 24hrs. Es importante entender el tiempo aproximado en cual ocurre cada fase del ciclo celular, ya que el tiempo nos hace entender la importancia de cada fase y la complejidad de los procesos que estan ocurriendo. Por ejemplo, sabemos que en mitosis ocurre la division del núcleo y del citoplasma (citocinesis), cual es un proceso relativamente rápido que toma 2 horas en completarse. La interfase se divide en tres fases G1, S, y G2. G1 es el proceso más largo dentro del ciclo celular tardando 11 horas en completarse. En esta etapa existen lo que se conoce como puntos de restriccion en los mamiferos y "start" en las levaduras. Los puntos de restriccion son puntos donde ciertas proteinas trabajan en conjunto para verificar si la division celular (mitosis) fue efectiva y si todas las celulas hijas fueron debidamente replicadas para así economizar la energia que se perderia replicando una celula que no tiene los componentes geneticos adecuados. En la fase S ocurre la replicación del DNA y se completa en 8 horas. La fase G2 se completa en 3 horas. Durante la fase G2 la célula continúa la síntesis de proteínas y ARN. Al final de este período se observa al microscopio cambios en la estructura celular, que indican el principio de la división celular. Solo la fase mitotica es observable por microscopio, el resto de las fases no.

El ciclo célular en células embrionarias se diferencia al ciclo celular llevado por celulas adultas. Las primeras etapas de este ciclo se conocen como segmentacion. En estas etapas se observa el aumento del numero de celulas en la estructura en crecimiento pero el tamaño de esta no aumenta. Esta corto ciclo va desde Mitosis hasta el periodo S sin estar mucho tiempo o nada en el periodo G1 y G2, garanizando asi la disponibilidad de todo el material genetico necesario para el desarrollo del embrion.

La mayoria de las celulas adultas llevan poca o ninguna actividad de division. La mayoria de estas celulas se encuentran arrestadas en la fase G0 (fase donde entran justo despue se salir de la fase mitogénica). Estas celulas permaneceran en esta fase hasta que reciban alguna señal que las induzca a seguir el ciclo celular entrando nuevamente a la fase G1. Estas señales se conocen como facteres de crecimiento. Teniendo en cuenta esto, podemos decir que las células se encuentran sujetas a ciertos controles positivos o negativos. Un factor positivo serian los factores de crecimeinto ya que estos inducen la division celular. Un factor negativo lo seria la inhibición por contacto. Esto ocurre cuando la division celular es tanta que ocupa todo el espacio disponible y las celulas comienzan a tener contacto entre ellas mismas inhibiendo asi la division entre ellas.

El echo de que los factores de crecimiento pueden acutar sobre el periodo de G1 ayuda a la activacion de genes tempranos o tempranos tardios, los cuales condifican proteinas importantes para el desarrollo de la célula. Esto tambien tiene mucha logica ya que la celula no comenzara a duplicar DNA ( actividad que consume grandes cantiadades de energía ) hasta que no reciba las señales necesarias para esto.

El ciclo celular eucaríotico


Resumen: El ciclo celular es la secuencia de eventos en el que la célula duplica su contenido y se los reparte entre dos células hijas. Es decir, la función básica del ciclo celular es duplicar el DNA en los cromosomas y luego segregar las copias del DNA en dos células hijas idénticas. El ciclo celular tiene 4 fases: G1, S, G2 y M, donde a G1, G2 y S se le conoce como la interfase.
 * Duración total: **24 horas**
 * Interfase
 * G1 (**11 horas**): etapa donde la célula crece y lleva a cabo procesos celulares comunes
 * Punto de restricción—esto ocurre cerca del final de G1 donde la célula se decide a comprometerse a llevar a cabo división celular; esto es importante porque es una manera controlada para que las células se repliquen debidamente y economicen energía; solamente se permite el paso a fase S bajo un ambiente favorable de crecimiento (e.g. la presencia de FGF (“fibroblast growth factor”) para fibroblastos o la presencia de nutrientes en el ambiente para levadura)
 * S (**8 horas**): ocurre la replicación del DNA; no puede occurir algunos proceso celular como transcripción o traducción
 * G2 (**3 horas**): la célula se prepara para llevar a cabo división celular mediante la síntesis de proteínas necesarias, etc.
 * Fase M (**2 horas**)
 * Mitosis—división del núcleo
 * Profase—se condensa los cromosomas replicados que consisten de dos hermanas cromatidasy se empieza a formar el huso mitótico
 * Prometafase—se desvanece la envoltura nuclear y se extiende los microtúbulos a través de la célula .Ya en esta fase los cromosomas se enlazan a los microtubulos del huso mitotico mediante los cinetocoros y se comienzan a mover.
 * Metafase—el huso mitótico alinea los cromosomas en el medio de la célula (el “metaphase plate”)
 * Anafase—el huso mitótico separa las cromátidas hermanas para formar dos cromosomas nuevos, los microtubulos se van acortando, o sea aqui es que ocurre como tal el proceso conocido como segregacion de cromosomas.
 * Telofase—se empieza a formar dos envolturas nucleares nuevas, los cromosomas se empiezan a descondensar, aqui termina el proceso de mitosis y la division del citoplasma comienza con la contraccion del anillo contractil.
 * Citocinesis—división del citoplasma por parte del anillo contractil el cual esta com puesto de filamentos de actina y de miosina


 * Interfase:** es el periodo más extenso del ciclo celular. Contiene G1, S y G2. Seguido de interfase está mitosis y luego de mitosis se comienza el ciclo nuevamente con interfase.

Dos periodos durante la interfase, antes y despues de la fase S: En ambas fases hay intensa actividad metabólica, crecimiento y diferenciación celular.
 * **G1:** se encuentra entre la fase M y la fase S. Aquí se da la mayor variación en la célula. Esta fase tiene gran interés en el estudio de la proliferación celular y en su control. Esto ya que en G1 las células pueden ser obligadas a comenzar la síntesis de DNA (fase S) y completar el ciclo ó bien pueden abandonar el ciclo celular y entra en la fase de reposo llamada **G0**. En G0 la célula permanece viable y activa metabólicamente, pero sin dividirse. Algunas celulas entran en G0 y nunca reinician ciclo celular, pero hay otras que ya estando en G0 pueden ser estimuladas para volver a G1 y continuar el ciclo celular. Para decidir si entrar a S luego de G1, la célula pasa por un check point llamado "Star" en la levadura ó "Restriction Point" en las células de mamíferos. Cuanto dura esta fase puede variar bastante dependiendo de las condiciones externas de la celula y de las senales extracelulares de otras celulas.
 * **G2:** se encuentra entre la fase S y la fase M. En el final de G2 el volumen célular prácticamente se ha duplicado, el DNA se ha duplicado y esta por iniciar el ciclo de mitosis.

A continuación las dos principales fases del ciclo celular:


 * **Fase S:** es la fase de mayor duración en el ciclo celular. En esta ocurre la duplicación de los cromosomas y la sintesís del DNA.
 * **Fase M:** se inicia una vez se ha completado G1, S y G2. Se divide en las fases de mitosis y citoquinesis. En mitosis ocurre la división nuclear y esta se subdivide en las siguientes fases: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. Durante citoquinesis la cual comienza durante el final de telofase ocurre la división del citoplasma y es cuando la célula se divide en dos y cada célula hermana recibe 1 de los dos núcleos.



**Puntos de cotejo (“Checkpoints”)** En el proceso de división celular, hay tres puntos de cotejo importantes que cotejan si la célula está llevando a cabo el ciclo celular correctamente y si la calidad del DNA está adecuada. De no cumplir con las regulaciones de estos puntos, la célula se arresta en este punto hasta que se corrija el problema o entra en apoptosis, un tipo de muerte celular programada. Los tres cotejos son:
 * 1) **“Restriction point”: Ambiente extracelular favorable?** Esto se coteja hacia el final de **G1**. Si hay un ambiente favorable, se prosigue con el ciclo celular
 * 2) **“G2/M checkpoint”: Aberraciones en el DNA?Ambiente Favorable?** Esto se coteja en las fases **G2** y **M**. Si el DNA está dañado o no se replicó completamente en fase S, se inhibe la producción de M-Cdk (“cycline-dependent kinases”); esta proteína es esencial para que comienze la fase M (se verá más a detalle más tarde).
 * 3) **“Metaphase-to-anaphase transition”: Cromosomas despegados del huso mitótico?** Esto se coteja en la fase **M**, donde se espera que los cromosomas se aten a los microtúbulos del huso mitótico mediante su cinetocoro lo cual lleva a que se complete mitosis y citokinesis. Si esto no ocurre, anafase (separación de las cromátidas hermanas) no ocurre y se espera hasta que todos los cromosomas estén atados al huso mitótico en metafase antes que ocurre anafase.

Existen proteínas que trabajan juntas para activar una serie de “switches” bioquímicos que se encargan de desencadenar eventos específicos en el ciclo celular. Lo que controla el ciclo celular son unos complejos Cdk-ciclina (“cyclin-dependent kinase—cyclin”).CdK's dependen de ciclina para su actividad, por lo tanto ciclina es una subunidad reguladora de los Cdk ya que sin esta los Cdk no tienen actividad de kinasas.Los niveles de ciclina durante el ciclo celular varian constantemente, sin embargo los niveles de los Cdk no varian durante el ciclo celular de organismos simples. El primer complejo de que activa al haber condiciones extracelular favorables en G1 es G1-Cdk, el cual a su vez estimula la expresión de genes que codifican por codificando G1/S- y S-ciclinas. Activaciones subsiguientes se encargan de llevar a cabo el ciclo celular.  Experimentos que estudian el control del ciclo celular  

** Experimento 1: Fusión de células ** Experimentos de este tipo ayudaron a contestar si hay factores que regulan el ciclo celular en el citoplasma de las células que se encuentran en dicho ciclo. Caso 1....................................................................Caso 2........................................Caso 3
 * **//Caso//** || **//Fase que se encuentran las células fusionadas//** || **//Resultado//** || **//Conclusión//** ||
 * 1 || G1 + S || Se induce la replicación del DNA en el núcleo en G1; el núcleo en S continúa replicando el DNA || Factores que inducen la fase S están presentes en el citoplasma de una célula en fase S y estos factores se pueden transmitir al citoplasma de celulas fusionadas G1/S. ||
 * 2 || G2 + S || El núcleo en G2 no vuelve a replicar su DNA; el núcleo en S continúa replicando el DNA || El DNA está “licenciado” a replicarse solamente una vez cada ciclo celular ||
 * 3 || M + G1 || Cromosomas se condensan prematuramente en los núcleos en G1, S, y G2 || Hay factores que inducen mitosis en el citoplasma de células que se encuentran en fase M ||
 * ^  || M + S ||^   ||^   ||
 * ^  || M + G2 ||^   ||^   ||

** Experimento 2: Levaduras sensitivas a temperaturas altas; //cdc// (“cell-division cycle”) mutantes ** Estos mutantes de levadura son sensitivos a temperaturas altas, lo cual implica que presentan un fenotipo “wild type” a temperaturas bajas (25) y presentan el fenotipo mutante a temperaturas altas (37). Esto permite crecer las células saludablemente pero también observar cómo se afecta el ciclo celular a temperaturas altas cuando se expresa el fenotipo mutante, osea logran apagar la funcion del gen. Se observan diferencia morfológicas en la división de dos especies de levadura. //Schizosaccharomyces pombe// (“fission yeast”) se alarga antes de dividirse y se divide equitativamente, su envoltura nuclear no se rompe durante mitosis mientras que //Saccharomyces cerevisiae// (“budding yeast”) se divide desigualmente su fase G2 no es normal. Es importante decir que ambos se replican de una manera haploide, osea, solo una copia de cada gen, lo cual los hace un buen organismo de estudio. Observar la morfología de células de levadura mutante durante división celular en comparación con células “wild type” //Saccharomyces cerevisiae// (“budding yeast”) A la izquierda se observa la división celular de células “wild type”; a la derecha se observan células mutantes arrestadas en una etapa de su ciclo celular, dado que no se desprenden las células hijas y empiezan a incorporar la misma cantidad de citoplasma comparado con la célula madre.
 * Características:**
 * Procedimiento:**
 * Resultados:**

//Schizosaccharomyces pombe// (“fission yeast”) El panel superior enseña células “wild type” dividiéndose; el panel del medio enseña células mutantes (//cdc25-22//) arrestadas en una etapa de su ciclo celular que tienen un largo más grande de lo normal, esto se debe a completan anafse pero no completan mitosis ni citokinesis; el panel inferior enseña células mutantes (//weeI-50//) que se dividen a la mitad del largo normal.

** Experimento 3: Marcaje con BrdU (5-bromo-2-deoxiuridina) ** Este análogo de timina se incorpora en el DNA de las células. BrdU se puede marcar con un anti-cuerpo fluorescente, se incorpora preferiblmente a DNA recien replicado Se incuban células con BrdU para que lo incorporen al DNA y luego se incuban con un anti-cuerpo fluorescente que sea específico para BrdU Se observan los cambios de posición que sufre el DNA durante la fase M del ciclo celular.
 * Características:**
 * Procedimiento:**
 * Resultados:**

** Experimento 4: Citometría de flujo ** Este instrumento puede medir la intensidad de fluorescencia de células marcadas fluorescentemente a una alta velocidad (miles de células por minuto).
 * Características:**

Se marca el DNA de células y se mide la intensidad de fluorescencia de cada uno. La intensidad de fluorescencia va a ser proporcional a la cantidad de DNA que hay en la célula. Se observa que en un cohorte de células, hay algunas que están en fase G1, otras en fase S y otras en G2 y M. Se ve que células en G1 tiene cierta cantidad de DNA (indicado por el número 1 en la escala arbitraria), que células en S tienen una cantidad intermedia de DNA, ya que están en el proceso de replicación, y que células en G2 y M tienen doble la cantidad de DNA en comparación con células en G1 (indicado con el numero 2). **Conclusión:** Se puede observar cuantitativamente la proporción de células en cada fase del ciclo celular. En un cohorte de células que tiene una baja tasa de mitosis, se observaría que habría un pico más grande en 1, mientras que en un cohorte de células que se dividen rápidamente, se esperaría ver un pico más alto en 2. Este método nos ayuda también en la identificación de alguna mutación en la que arreste a las células de estudio en alguna de las fases antes mencionadas.
 * Procedimiento:**
 * Resultados:**

** Experimento 5: Los ovocitos de ranas ** Ovocitos no fertilizados están normalmente arrestados en fase G2. Sin embargo, al estar expuestos a progesterona, los ovocitos llevan a cabo meiosis hasta quedar arrestados en metafase II. Solamente cuando se fertiliza el ovocito es que se completa meiosis y entonces ocurre la fusión de los núcleos de los gametos. **Procedimiento:** Se removió el citoplasma de ovocitos arrestados en metafase II (expuestos a progesterona). De ese citoplasma, se aisló un componente necesario para el ciclo celular. En un experimento, se inyectó el citoplasma extraído en un ovocito arrestado en G2 (no expuesto a progesterona) y en otro experimento, se inyectó el componente aislado en un ovocito arrestado en G2 también. Se indujo la meiosis en ambos ovocitos que se les inyectó o el citoplasma extraído o el componente aislado
 * Características:**
 * Resultados: **

El componente aislado que está en el citoplasma de ovocitos arrestados en metafase II induce la maduración de un ovocito arrestado en G2. Ese componente aislado se nombró **MPF** (“__m__aturation/mitosis __p__romoting __f__actor”)
 * Conclusión: **

Se estudio la actividad de MPF a través del ciclo celular de un ovocito en proceso de maduración, y se observó lo siguiente 
 * Estudios subsiguientes:**

** Experimento 6: Embriones de erizos ** Células embrionarias se dividen rápidamente, lo cual las hace ideal para estudiar el ciclo celular Se mide la cantidad de ciclina B y el porciento de células dividiéndose a intervalos de 10 minutos. La siguiente gráfica presenta los resultados. El aumento transitorio de ciclina induce que haiga un aumento en el número de células dividiéndose. Esto implica que esta ciclina induce/regula la mitosis.
 * Características:**
 * Procedimiento:**
 * Resultados: **
 * Conclusión: **

** Experimento 7: Sistema libre de células ** En este sistema, ocurre la división nuclear con la formación del huso mitótico y cromosomas. La ventaja de este sistema es que se puede controlar qué factores están presentes en el las etapas del ciclo mitotico. (//Nota//: En este sistema, ocurre la traduccion de proteinas.) Se incuban las reacciones donde ocurre la división nuclear y se mide la concentración de cyclina B y la actividad de MPF a diferentes tiempos despues de iniciar el ciclo de mitosis con el añadir de un nucleo de un espermatozoide y ATP. Las reacciones fueron las siguientes: (//a//) no tratada (control), (//b//) tratada con RNasa, (//c//) tratada con RNasa y luego se le añadió el mRNA que codifica para ciclina B “wild type”, y (d) tratada con RNasa y luego se le añadió el mRNA que codifica para una ciclina B que no es degradable por proteasas. Las siguientes gráficas presentan los resultados de los experimentos. //Nota//: Las barras azul claro representan las etapas tempranas de mitosis. Las barras anaranjadas representan las etapas tardías de mitosis. (a) Se ve que la concentración de ciclina B y la actividad de MPF aumentan y disminuyen sincronizadamente durante mitosis (b) Se ve que al degradar todo el mRNA presente, lo cual elimina la producción de proteínas como ciclina B, no ocurre mitosis (c) Se ve que al eliminar todo el mRNA presente pero luego añadir el mRNA correspondiente para ciclina B “wild type”, lo cual permite que se produzca esta proteína, se restaura el ciclo de mitosis como en el control (a) (d) Se ve que al tener la presencia de una ciclina B no degradable, se comienza el proceso de mitosis pero se arresta porque no se pudo degradar ciclina B. Se requiere la producción (a partir de la traducción del mRNA correspondiente) y destrucción (por proteasas) de cyclina B—lo cual forma parte del complejo de MPF—para que ocurran todas las etapas de mitosis.
 * Características:**
 * Procedimiento:**
 * Resultados:**
 * Conclusión:**

**Proteinas Reguladoras de ciclo celular (Clase 24 de noviembre):**

Proteínas que regulan el ciclo celular están reguladas por una compleja red de proteínas que se encargan de modificar la actividad de Cdk. Están reguladas por procesos de fosforilación y defosforilación y también por asociaciones de Cdk a proteínas inhibidoras y de activación de proteínas que le añaden grupos de ubiquitina y dirigen a ciclina a ser degradada o a otros componentes a ser degradados. También los niveles de ciclina, ya sean altos o bajos, es el determinante primordial de la actividad de Cdk durante el ciclo celular.

Proteinas reguladoras forman complejo de kinasa dependiente de ciclina con CDK y ciclina.
 * Kinasa dependiente de Ciclina:
 * Son Kinasas que tienen que estar asociadas con una ciclina para poder llevar acabo su actividad de kinasa.
 * Forma complejo de Kinasa dependiente de ciclina
 * Es un complejo de proteinas formado periodicamente durante el ciclo celular a medida que el nivel de ciclina aumenta. Es entonces cuando una kinasa dependiente de ciclina es parcialmente activada.
 * Diferentes complejos de Kinasas dependientes de ciclina y ciclina activan diferentes pasos en el ciclo de division celular mediante la fosforilacion específica de target proteins.
 * La ciclina es la proteina reguladora
 * Kinasa dependiente de Ciclina contiene:
 * Actividad como Kinasa
 * Sitio activo
 * Lugar de enlace para ATP
 * Grupo fosfato, el cual tiene función para fosforilar otras proteínas efectoras de ese complejo
 * Fosforilacion en la Kinasa la activa
 * Defosforilacion en la Kinasa la inactiva
 * Uno de los puntos de control del complejo lo es la fosforilacion o defosforilacion de la kinasa.
 * La actividad de la Kinasa aumenta y disminuye a medida que la celula progresa por el ciclo celular, causando cambios ciclicos en la fosforilacion de proteinas intracelulares que inician o regulan los eventos mas importantes en el ciclo celular. Es importante saber que que las concentraciones de Cdk no variana durante el ciclo y esta exceden a la concentracion de ciclinas que hay. Tambien el complejo APC/C inicia la transcicion de metafase a anafase.
 * Ciclina es una proteina reguladora que causa los cambios ciclicos en la actividad de las Kinasas dependientes de ciclinas. Si la ciclina no esta enlazada a la Kinasa dependiente de ciclina esta no presenta actividad de Kinasa. Por esta razon ayuda a controlar la progresion de etapa a etapa del ciclo celular.
 * Ciclina sufre un ciclo de sintesis y degradacion en cada ciclo celular mientras que el nivel de Kinasas dependientes de ciclina se mantiene constante.
 * Los cambios ciclicos de la ciclina resultan en la formacion y activacion de complejos de kinasa dependiente de ciclina y ciclina.

Cuando Cdk está activada, está fosforilada en un residio que, cuando está fosforilado, le confiere actividad a la enzima. Sin embargo, cuando la quinasa Wee1 fosforila a CDK en otro residuo, se inactiva Cdk. Para remover el grupo fosfato inhibitorio, se necesita una fosfatasa llamada Cdc25, las cuales aumenta la activacion de Cdk.
 * Factores determinantes de la actividad de CDK: **
 * Ejemplo de qué hace Wee1 en el ciclo celular **



Usando el modelo de la levadura, se ve que se requiere de una ciclina mitótica para iniciar mitosis. Inicialmente, la ciclina está fosforilada en la posición activadora e inhibidora. Luego, una fosfatasa remueve el grupo fosfato inhibitorio, así dejando la proteína activada. Esto causa que se inicie mitosis. Una levadura mutante que tiene un Wee1 no funcional va a tener la ciclina siempre acti va, lo que resulta en una mitosis temprana. La morfología de la célula cambiaria, la célula no crece muy bien ya que el proceso de división ocurre más rápido. Por otro lado, cuando se tiene Cdc 25 no funcional no ocurre la activación de Cdk (no pasa de G2 a M). También si hay un exceso de Wee 1, no va a ocurrir división y si hay exceso de Cdc 25 va a ocurrir una división temprana. Demostrando asi el papel que juega Cdc como un control importante en el punto de cotejo que determina si la celula esta lista para replicarse.

** El control del ciclo celular depende de la activacion de las kinasas (Cdks) dependientes de la ciclina

Hasta ahora se han encontrado 12 ciclinas en el genoma humano. Existen cuatro clases de ciclinas, las cuales son identificadas por la etapa en que se enlazan al Cdk en el ciclo celular: **

>
 * ** G1/S-ciclinas: en la etapa tardia de G1, esta activa Cdk. Luego sus niveles de funcionamiento bajan en la fase S. ** Permite la entrada al ciclo celular.
 * ** S-ciclinas: se ensamblan a Cdk luego de la primera fase, y estimulan la duplicacion del cromosoma. Estas se mantienen activas hasta la mitosis. Esta ciclina contribuye a el control de los eventos iniciales en mitosis. **
 * ** M-ciclinas: activan Cdk que estimulen la entrada a mitosis en el chekpoint G2/M. Su concentracion baja en la etapa mediana de mitosis debido a mecanismos que destruyen las ciclinas -M. **
 * G1-ciclinas: ocurre en la mayoria de las celulas, ayuda a regular las actividades de las ciclinas G1/S. [[image:ciclo_celular.jpg width="680" height="287" align="center"]]

Es importante saber que las concentraciones de las ciclinas cambian durante el ciclo celular, mientras que la concentracion de los Cdks no cambia y excede la cantidad de ciclinas que se encuentran. Por ejemplo, como podemos ver en la figura anterior, la proteina reguladora APC/C inicia la transicion de metafase hacia anafase. En las celulas de los vertebrados hay cuatro CdK como mencionamos anteriormente, dos de ellas interactuan con las Ciclinas-G1, una con G1-S y S-ciclinas y la otra con las ciclinas M. Una manera de pode explicar como los diferentes complejos de ciclina afectan o intervienen en diferentes ciclos de la celula se puede deber a que que esta ciclina no solo activan a su Cdk correspondiente, sino que tambien las dirige a las proteinas blanco correspondientes.

 La Fosforilacion Inhibidora y proteinas inhibidoras de CdK ( CIKs) inhiben la actividad de CdK:

Una de las maneras de inhibir la actividad kinasa de complejo de Cdk es por medio de fosforilacion inhibidora de las mismas, esto se lleva a cabo por Wee1 ( es a su vez una kinasa), al contrario de esto la fosfatas Cdc5 aumenta la actividad de Cdk. Tambien se puede inactivar por medio de un complejo CKI, como por ejemplo el mencionado en clase p27


 * El control del ciclo celular depende de la proteolisis ciclica **

La ciclina se puede destruir en momentos específicos del ciclo. Una proteína que tiene esta capacidad es el complejo **APC/C** (anaphase-promoting complex). El complejo APC/C es una enzima que pertenece a la familia de ligasas de ubiquitina, estas tienen multipkes copias de ubiquitina lo que resulta en la destruccion proteolitica por los proteosomas. Esta se encuentra inactiva, pero al activar se mediante al ensamblaje con una subunidad activadora (debido al ensamblaje de la proteína Cdc20 quien es activada por la actividad de M-Cdk), cataliza ligamiento de ubiquitina a proteínas relacionadas a la salida de mitosis tales como: securina, S-ciclina y M-ciclina. Al destruir securina la cual se encarga de mantener las hermanas cromatidas juntas en mitosis temprana, la destruccion de securina activa una proteasa que separa las hermanas cromatidas. Al destruir todas las ciclinas S y M hace que se in active la mayoría de las Cdk en la célula. Estas luego de ser ligadas con ubiquitina se degrada en protosoma y la Cdk se liberan. Cuando las G1/S-Cdk son activadas en la fase tardia de G1, el complejo APC/C se apaga, lo cual permite la acumulacion de ciclina para que pueda empezar el proximo ciclo.

Otro tipo de ligasa de ubiquitina es la **SCF**. Esta tiene la capacidad de ligar ubiquitina al inhibidor de Cdk (CKI) en la etapa tardía de G1 y por lo tanto juega un papel en la replicación del DNA y en la activación de S-Cdks, el cual tiene que ser fosforila do por una kinasa p ara que este proceso se realice. (Este siempre está activo y reconoce cuando la proteína está fosforilada)



APC/C y SCF son regulados de diferente manera,la actividad de APC/C varia durante el ciclo celular (debido a su asociacion con Cdc20 durante anafase y su asociacion con Cdh1 desde mitosis tardia hasta G1 temprana). Pero a diferencia de APC/C, la actividad de SCF se mantiene constante durante el ciclo celular. La degradacion de ciclina, por medio de APC/C, es lo que hace irreversible el ciclo.

 El " Sistema de Control del Ciclo Celular" depende:

a.) Los mecanismos que controlan la actividad de los complejos Cdk:

- Fosforilazion de las subunidades de Cdk - la union de las proteinas inhibidores de Cdk (CKI) - La proteolisis de las ciclinas - Cambios en la transcripcion de los genes que codifican para reguladores de Cdk.

b.) Los complejos de ligasas de ubiquitina:

- los complejos de APC/C y SCF los cuales catalizan la ubiquitilacion y la destruccion de proteinas reguladoras que controlan los eventos criticos en el ciclo celular

 La activacion de M-Cdk: ​

Mitosis es tradicionalmente dividida en: //profase, pro-metafase, metafase, anafase y telofase//. Al inicio de la mitosis es notable la condensación de cromosomas, en células animales M-Cdk promueve la descomposición de la envoltura nuclear y el rearreglo del citoesqueleto de actina y del Aparato de Golgi; además del ensamblaje del huso mitótico y la fijación de los cromosomas a este (huso mitótico). Una vez los cromosomas están pegados al huso mitótico crean cierta tensión, cuando esta tensión llega a un nivel optimo se comienza activar APC/C. ​ En la clase se hablo sobre el inicio de la activación de M- Cdk, este proceso necesita M-ciclina y un aumento de esta lleva a un aumento de M-Cdk. M-Cdk es phosforiladose en el sito activo por CAK (Cdk-activating kinase) o inhibido por Wee 1. La activación de M-Cdk se lleva a cabo por medio de la fosfatasa Cdc 25 la cual remueve los fosfatos inhibidores que se encuentran en M-Cdk, resultando en un “positive feedback”, lo cual asegura que la actividad de M- Cdk va a aumentar. En fin la activación de M-Cdk al final de G2 es regulada por Cdc 25.

En la transición de Metafase –Anafase el APC/C es activado por Cdc 20, después que se alcanza la tensión óptima entre el cromosoma (cinotocoro) y el huso mitótico, produciendo la destrucción de securina. Al destruirse serurina se libera separasa, la cual permite la disociación de la cohesion entre las “sister chromatic”, o sea permite la separación de las “sister chromatic” hacia los polos de la célula. Finalmente hay un aumento de APC/C por medio de Cdh1, el cual da paso a l destrucción de cicilina S y M, Cdk se inactiva, activación de las fosfatasa que: desfosforilan los “Cdk targets”, disociando así el huso y reformándose la cobertura nuclear.



Cohesin
Una vez se replica el DNA,osea, al final de la fase S, las cromátidas hermanas están unidas por un complejo de proteínas llamado cohesin,complejo de proteina con 4 subunidades, las cuales se encuentran en varias partes alrededor de las cromátidas hermanas. Cohesin forma estructuras con forma de anillo, y durante metafase esta estructura solo se puede ver alrededor del cinetocoro. Para que se pueda llevar a cabo anafase, estas proteínas tienen que ser destruidas. El proceso comienza cuando Cdc20 activa a APC/C, quien degrada a securina. Securina estaba inhibiendo a separasa, pero con la activación de APC/C, ahora separasa puede degradar a cohesina y las hermanas cromátidas se pueden separar. Las hermanas cromátidas se separan con los "pulling forces" del huso mitótico. En las células animales, la fosforilación de los Cdks también inhiben a las separasas, por lo cual la degradación de los Cdks por APC/C, también ayuda a la separación de las hermanas cromátidas.

**Figuras importantes:**

Figure 17-24 Cohesin

Figure 17-44 The initiation of sister-chromatid separation by the APC/C

 Los Mitogenos estimulan la actividad de G1-Cdk y G1/S-Cdk:



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En la clase hablamos como es que ocurre y cuál es el mecanismo que inicia la fase S del ciclo celular. Los factores de crecimiento o las señales mitogenicas son factores extracelulares que se enlazan a los receptores en la membrana para iniciar una respuesta intracelular, estimulando la expresión de ciclina G1. O sea las señales mitogenicas controlan, en la mayoría de las células animales, la rapidez de la división celular en la fase G1 lo cual hace que estos propicien la actividad de Cdk que permite la iniciación de la fase S. Uno de los mecanismos principales que fue discutido en clase se lleva a cabo mediante la activación de la GTPasa Ras, la cual activa la cascada de kinasas MAP discutido en el capítulo 15. Al activar la cascada ocurre un aumento en la proteína Myc, a su vez esta proteína aumenta la expresion de genes que codifican para G1 ciclinas (D ciclinas) lo cual aumenta la cantidad de G1-Cdk. Una de las funciones mas importantes de los complejos de G1-Cdk es activar un grupo de factores reguladores de genes conocidps como E2F, los cuales se enlzan a secuencias especificas del DNA de genes que codifican para varias proteinas que se requieren para poder entrar a la fase S como , G1/S-ciclinas y S ciclinas y proteinas envueltas en la sintesis de DNA y en la duplicacion de cromosomas. En ausencia de los mitogenos, se inhibe la expresion de las proteinas E2F debido a la interaccion de estas con inhibidores conocidos como Retinoblastomas (Rb). Sin embargo en la presencia de mitogenos, G1-Cdk se acumula y fosforila a los Rb lo cual reduce que estos inhiban a los E2F.======

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La importancia discutida en clase de las proteínas Rb radica en que estas proteínas se encuentran mutadas en la mayoría de los cáncer, cuanto esta proteína no está mutada actúa como un supresor de tumores. Por lo tanto, esta proteína inhibidora de la proteína E2F es importante en la búsqueda de drogas para tratar el cáncer. Esta proteina fue identificada originalmente atraves de los estudios de una enfermedad de cancer hereditario conocida como retinoblatoma.======

Replicación de DNA

 * Ensamblaje del complejo de pre-replicación **

Para que una célula se asegure de que su DNA se copie una sola vez durante su ciclo celular utiliza un mecanismo complejo. La iniciación de la fase de replicación de DNA (ADN) se divide en 2 pasos principales: el primero ocurre entre la mitosis tardía y la fase G1 temprana, el segundo paso ocurre al inicio de la fase S. Si comenzamos entre los finales de mitosis y principios de G1, podemos apreciar la formación del complejo pre-RC (prereplicative complex) en el origen de replicación de la célula. Este origen de replicación es una secuencia consenso en las levaduras, mientras que en el resto de los ecuariotas se cree que es al azar. Por lo tanto, en células eucariotas hay muchos orígenes de replicación ya que se desea que el proceso ocurra rápidamente y al haber mayor número de orígenes, hay mayor probabilidad que ocurra la replicación. Este paso también es conocido como el licenciamiento al origen de replicación para poder comenzar el proceso de síntesis de DNA. Las proteínas más importantes del complejo pre-RC son las siguientes:

• Mcm - se adhieren al ORC mediante Cdc6 & Cdt1 y funciona como helicasa.


El ensamblaje del pre-RC ocurre solamente en la parte tardía de M y en la parte inicial de G1, ya que el ensamblaje es inhibido por la actividad de Cdk y estimulado por la actividad de APC/C.

El segundo paso ocurre cuando la célula entra S, la actividad de APC/C baja mientras que S-Cdk está activo(ya sea por fosforilacion o por destruccion de los inhibidores), esto causa el desensamblaje del pre-RC, S-Cdk fosforila ORC y Cdc6 (es degradado) y la inhibicion de Cdt1 por geminina (la cual volvio a aumentar por la disminusion en la actividad de APC/C) como no es hasta tarde en mitosis que la actividad de APC/C vuelve a subir, la célula no tiene manera de volver a replicar su DNA. S-Cdk estimula el ensamblaje del preinitiation complex quien activa a Mcm (Helicasa),que a se vez desenrolla el origen y asi se da comienzo la replicacion de DNA.


 * La proteína Cdt1 es activada cuando sube el nivel de APC/C ya que el APC/C activado destruye la proteína geminina al ligarlas con ubiquitin. **Geminina** proteína está pegada al Cdt1 y la mantiene inactiva. Pero cuando APC/C se apaga en la parte tardía de G1, geminin se acumula y vuelve a inactivar a Cdt1.


 * La proteína Cdc6 & el ORC son inactivados por S-Cdk, quien los fosforila.

**Figuras importantes:**

Figure 17-22 Control of chromosome duplication

Figure 17-23 Control of initiation of DNA replication

Ambas de: Molecular Biology of The Cell, 5th Edition

Resumen de las Proteinas Reguladoras que Participan en el Ciclo Celular


Regulación del ciclo celular
 * NOTAS DE CLASE II (Noviembre 24, 2009)**

Repasamos los mecanismos de regulación del ciclo celular en el que la célula utiliza distintos mecanismos para regular los componentes que participan durante el mismo. Un ejemplo que estudiamos en el salón fue la activación de M-Cdk (Fig.17-25) y su regulación por fosforilación por kinasas que activan o inhiben su actividad. Una vez Cdk1 se asocia con la M-cyclin, el complejo es fosforilado en el sitio activo por CDK que activa parcialmente al mismo ya que es fosforilado por Wee1 en la posición en la que inhibe el complejo (a lo que la profesora se refirió como una acelerar y frenar un carro). Para activar el complejo y aumentar su actividad súbitamente, Cdc25 remueve el fosfato inhibitorio al final de la G2. Esto actúa como un tipo de “positive feedback” ya que la actividad del M-Cdk, estimula la actividad de Cdc25 e inhibe Wee1.

Proseguimos a observar unas imágenes donde se mostraban los resultados de mutaciones que ocasionaban que no se produjera ( ausencia ) Cdc25 y Wee1. Si hay ausencia de Cdc25 el ciclo celular se queda en G2. Como no se activan la M-Cdk, no hay Mitosis porque no se elimina el fosfato inhibitorio. Como resultado observaremos un fenotipo alargado ya que no se divide. Si hay una mutación en Wee1 que afecte la producción de la misma el ciclo, no se queda suficiente tiempo en G2 ya que no se va a fosforilar el lado que inhibe al complejo. Esto va a ocasionar un fenotipo acortado. ¿Cómo podemos generar estos mismos fenotipos? Pudiéramos generar el primer fenotipo con exceso de Wee1 y el segundo con exceso de Cdc25. El efecto de estas proteínas en el ciclo celular se pueden observar en los puntos de cotejo, como por ejemplo, el “checkpoint” de entrada mitosis. Cdc25 actúa sobre la activación de la M-Cdk. Es importante que la célula desarrolle mecanismos para determinar si la replicación ocurrió de forma completa y sin errores. Si se detecta un error, inhibo la actividad de Cdc25 para que la célula no prosiga en el ciclo. Podemos observar distintos puntos durante el ciclo celular en los cuales inhibidores inhiben las ciclinas cdk por que se detecta un error o por señales ambientales, determinantes intracelulares, disponibilidad de nutrientes, etc. Otros determinantes son los inhibidores del complejo cdk. Estos pueden ser de la famila p16 que evita la ciclina cdk de ensamble. También puede ser por medio de la familia p27, quien se ensambla al complejo y lo inhibe. Al remover estos inhibidores se puede continuar con el ciclo.

Otra manera de regular el ciclo es restringiendo la localización de los componentes del mismo. La profesora nos enseño una imagen de fluorescencia de una célula en la que se puede observar la misma durante distintas etapas del ciclo celular, localizando la Cyclin B1. Observamos como la misma (paneles 5-6) se mantiene en el citoplasma y a medida que transcurre el tiempo se va traslocando al núcleo. En los paneles 12 y 13 vemos la transición de anafase a telofase, en donde se activa APC/C y se destruye la ciclina.

PROTEOLYSIS OF CYCLIN Habíamos observado que una de las regulaciones principales es destruyendo la ciclina. Unos de las proteínas responsables de degradar a las ciclinas son las SCF y APC/C. Estas transfieren múltiples copias de una proteína pequeña llamada “ubiquin” a proteínas específicas. Las proteínas marcadas son degradadas por proteosomas.

La actividad de SCF depende de unas subunidades llamadas “F-box”. SCF “ubiquilates” algunos CKI durante el G1 tardío ayudando a si a la célula a activar sus S-Cdks e iniciar la replicación de DNA. La actividad de APC/C depende de sus subunidades Cdc20 o Cdh1. Estas subunidades ayudan a APC/C a reconocer a las proteínas que tienen que degradar. APC/C hace que se destruyan las ciclinas S y M, que resulta en la inactivación de los Cdks y la desfosforilación de las proteínas afectadas por los Cdks, que es importante para los eventos que ocurren en M. Otra manera que la célula tiene para controlar el ciclo es la regulación de la transcripción de sus componentes. Para la transición del ciclo es importante que las cíclicas se degraden, pero estas tienen que ser sintetizadas nuevamente. Esto hace imposible dar reversa en el ciclo porque necesito las señales necesarias que me ordenen re sintetizar las ciclinas, manteniendo la unidireccionalidad del ciclo.

En el genoma humano se han identificado 12 ciclinas.

Podemos observar una célula que esta en el ciclo o que estaba en G0 y toma las señales para entrar al ciclo. “Senescence” – permanente fuera del ciclo porque están bien diferenciadas. Muchas de las células de nuestro cuerpo están en este estado. En estas la expresión de los genes que transcriben para Cdks y ciclinas, están permanentemente apagados evitando que ocurra división celular. Las que pueden salir de G0 mantienen la habilidad de montar nuevamente estos complejos cuando son estimuladas.

Cuando observamos la imagen del ciclo eucariota, es durante la etapa de G1 donde los factores de crecimiento pueden tener efecto. Los factores de crecimiento estimulan el crecimiento de la célula promoviendo la síntesis de proteínas y otras macromoléculas y evita su degradación. De G0 puede pasar a G1 en respuesta a los factores de crecimiento que van a tener efecto ANTES del punto de restricción. Aunque se los quite luego de esto, la célula ya esta comprometida a continuar el ciclo celular.

Si es una celula que ha estado en el ciclo, ya al final de M se empiezan a sintetizar las ciclinas G1-Cdk. Estos complejos pueden estar inhibidos por inhibidores como los presentados anteriormente y cuando la célula recibe señales que le indican que puede continuar estas son activadas. Una célula que se encuantra en G0 tiene que tomar mecanismos distintos porque tiene que sintetizar ciclina G1 de “scratch” utilizando factores de crecimientos, como por ejemplo los “Mitogens” (ej. PDGF derivado de las plaquetas). Estos estimulan el ciclo celular.

Los “Mitogens” controlan el “rate” de la división celular ya que actúan sobre G1. Como discutimos, hay mecanismos que inhiben la actividad de Cdks en G1 y bloquen la entrada hacia S. Los “mitogens” liberan a las Cdks de estos frenos permitiendo que el ciclo prosiga hacia S. Una vez activa, G1-Cdk activa un grupo de genes reguladores llamados E2F, que se ligan a secuencias de DNA especificas en los promotores de una gran variedad de genes cuyos productos son proteínas requeridas para la S como, G1/S-ciclinas, S-ciclinas y otras proteínas envueltas en la síntesis de DNA. En ausencia de la estimulación por los “mitogens” E2F esta inhibida por la interacción del mismo con la proteínas de retinoblastoma (Rb). Cuando las células son estimuladas para dividirse, complejos activos de G1-Cdk se acumulan y fosforilan al Rb, reduciendo su afinidad por E2F. Esto es otro “positive feedbak” ya que esto ayuda a la transcripción de sus mismos genes. (FIG 17-62) Rb- TUMOR SUPRESOR GENE. Su producto es supresor de tumor que estando activo inhibe el factor de transcripción y así inhibe el ciclo celular. Cuando el factor esta mutado,ocurre replicación excesiva aunque hayan errores en el producto del gen. Se descubrió en cáncer en la retina de los niños.


 * Orígenes de replicación**

Las células ensamblan maquinaria de replicación en distintos orígenes. Hay consenso sobre la localización de los mismos en levaduras pero, no hay unas secuencias identificadas para eucariotas. Puede ser que estén determinadas al azar. En levaduras hay 400 orígenes en 16 cromosomas. Esto quiere decir que se necesitan múltiples orígenes para que se replique de manera rápida aunque es bastante complejo, ya que se deben replicar de manera sincronizada. El Complejo de replicación es a lo que nos referíamos como la LICENCIA de replicación cuando pasa de G2 a S. Estos se ensamblan en G1. Para asegurarse que la duplicación de cromosomas ocurre solo una vez durante el ciclo celular, la iniciación de la replicación del DNA se divide en dos pasos que ocurren en distintos puntos del ciclo celular. El primero ocurre durante a finales de M y principios de G1 en el que se enlaza el “Pre-replicative complex” (licencia). El segundo ocurre durante S donde se forma un complejo más grande llamado “pre initiation complex”, quien ayuda a iniciar la síntesis de DNA. Este complejo solo se puede formar una vez por ciclo. La formación de el pre-RC esta inhibido por la actividad de las Cdks y es estimulado por APC/C, por esta razón ocurre en M tardío y G1 temprano. En S, la activación de S-Cdk activa la formación del “pre initiation complex”. ¿Cuáles son las proteínas que componen estos complejos? Los componentes son ORC (origin recognition complex), Cdc6 y Cdt1. Estas últimas a su vez ayudan a la asociación de las Mcm, las cuales se ha pensado que tienen actividad de helicasas. Al comenzar la replicación del DNA, S-Cdk hace que se desensamble algunos de los componentes del pre-RC del origen. Cdks fosforilan al ORC y al Cdc6. Además, la inactivación del APC/C también ayuda a apagar el pre-RC, ya que este hace que se destruya una proteína llamada geminin, que inhibe la actividad de Cdt1. Cuando se apaga APC/C, se acumula geminin e inhibe a Cdt1. El ciclo de replicación NO SE PUEDE REPETIR (FIG 17-23).

Importante sobre APC/C: Durante G1 – APC/C esta activo Durante S-G2 esta inactivo Durante metafase – anafase se activa

Al final de de G1, se inactiva APC/C y la cyclina se empieza a acumular

S-Phase Queremos sintetizar el DNA por lo tanto necesito S-Cdk. Este esta inhibido por un inhibidor y para removerlo necesito ligarle ubiquitina y degradarlo. Al final del G1 se fosforila el inhibibidor y el complejo SCF lo ubiquila. También pasa por los “checkpoints” que revisan la calidad del DNA.

G2 En G2 se acumula M-cyclin-CDK .Se sintetiza y se ensambla el inhibidor y es inactivada hasta que se activa súbitamente a través de Cdc25.

M PHASE - Tardio

Hay sensores en el huso mitotico que me detectan la tensión y se activa APC/C por Cdc20. APC/C “ubiquilates” y destruye a “Securin” quien normalmente aguante a las separasas en un estado inactivo. Al desaparecer Securin las separasas destruyen a la cohesin, un complejo que unía las cromátidas hermanas. Al final del ciclo al subir la actividad de APC/C se destruye S y M cyclin, se inactiva las Cdks, se desesensambla el splindle y se reforma el nuclear envelope.

DNA DAMAGE RESPONSE Cuando se detecta un daño en el DNA por un error en la replicación, es esencial que la célula repare este daño antes de continuar el ciclo. El control celular del ciclo puede arrestar el mismo en dos “Checkpoints”. Uno es el G1 tardío especificamente en el punto de restriccion, que previene que se entre en S y el segundo es en el G2/M checkpoint, que evita que entre en Mitosis. Para esto, utiliza kinasas que fosforilan proteínas que causan el arresto del ciclo celular, dos de ella son ATR y ATM.Uno de los "targets" mas importante de estas kinasas es la proteina reguladora P53, la cual estimula la transcripcion de genes que codifican para la proteina CKI conocida como P21 la cual se enlaza a G1/S-Cdk y S-Cdk e inhibe sus actividades lo cual ayuda a bloquear la entrada al ciclo celular. Normalmente p53 está en concentraciones bien bajas en células normales pero en células en que hay un daño en el DNA, las cantidades de p53 aumentan ya que su afinidad por Mdm2 disminuye. Esto estimula a que p53 estimule la transcripción de genes que transcriben para la proteína CKI p21. Mutaciones en p53 hacen que este pierda su función, permitiendo a las células que acumulen sus mutaciones. P53 esta mutado en la mayoría de los cánceres.