14.+Senales+intercelulares+III

Introducción de Aspectos Básicos Generales


 * COMUNICACIÓN INTERCELULAR**

GTP-binding proteins=GTPases Fig1: Estructura de GTP y GDP. Asociación y disociación de estos nucleótidos a la Proteína G controlan el efecto que tentrá esta sobre un efector durante los procesos de cascada de senales intracelulares.
 * Proteínas que tienen la capacidad de interaccionar con GTP y GDP. Las mismas pueden hidrolizar el GTP ligado a GDP, por lo que se le llaman GTPasas.
 * Dependiendo de la conformación en la que se encuentren presentarán diferente afinidad a GDP o GTP.
 * En la medida que se remuevan o añadan grupos fosfatos se regularan diferentes procesos celulares. Se reconoce que estas proteinas ligadas al GTP permanecen activadas mientras que al ligarse con GDP son desactivadas.
 * Es importante recordar que el GDP o GTP estén enlazados a una GTPasa en específico depende de otras proteínas reguladoras como GAP y GEF.

Un ejemplo es la actividad como GTPasa de Rac-1. Esta proteina esta siendo estudiada como un posible modulador en la integridad de la barrera endotelial pulmonar como parte de las cascadas de señal de PKC y Fosfatasas en la célula ( //Experimental Cell Research// 308:407-421 ). El estudio se basa en que la misma podria servir como objetivo de alguna droga reguladora en funcion del mejoramiento de personas con problemas respiratorios. Como las demas GTPasas, ella cicla entre un estado activado ligado a GTP y desactivado ligado a GDP mediado por otras proteinas.

Requerimientos y componentes básicos para la transducción de un mensaje en el exterior de la célula al interior para producir una respuesta intra- o extra-celular.


 * Ligando
 * Receptor
 * G-Protein
 * Efectores
 * El que envuelve la ruta de cAMP es Adenylyl Ciclasa
 * El que envuelve la ruta de PI y DAG es Fosfolipasa C
 * Rutas principales que envuelven mensajeros secundarios
 * c-AMP
 * PI/DAG
 * Terminación de la señal

LIGANDOS

Pueden ser:
 * Compuestos sensitivos a la luz
 * Hormonas
 * Feromonas
 * Neurotransmisores
 * Su tamaño varia y puede ser desde pequeñas moléculas, péptidos o proteínas de gran tamaño
 * Fotones

RECEPTORES
 * Existen 6 Clases y están clasificados en base a su función y estructura.


 *  Class A (or 1) (Rhodopsin-like)
 *  Class B (or 2) (Secretin receptor family)
 *  Class C (or 3) (Metabotropic glutamate/pheromone)
 *  Class D (or 4) (Fungal mating pheromone receptors)
 *  Class E (or 5) (Cyclic AMP receptors)
 *  Class F (or 6) (Frizzled/Smoothened)
 * Son proteínas Integrales
 * Una sola cadena de polipeptidos con 7 helices transmebranales
 * Sufre un cambio conformacional cuando un ligando se enlaza
 * El primer GPCR al cual se le descubrió su estructura fue
 * Rhodopsin (Fig. 3)


 * El primer receptor humano en resolverse la estructura fue
 * B2- Adrenérgico
 * Algunas de las funciones envuelven:
 *  Responder a la presencia de la hormona epinefrina la cual a su vez es sintetizada por las glándulas adrenales y promueve:
 * Aumento en presión
 * Glicógenolisis
 * Liberación de glucosa del hígado entre otras
 * β2 es encontrado en músculos esqueletales y lisos y en el hígado promoviendo también bronco-dilatación y vasodilatación.

PROTEINA G α con una segunda proteina)
 * GTPasas trimericas.**
 * Se activa cuando un receptor en la membrana sufre un cambio en su estructura
 * Compuesta de 3 sub-unidades (Fig.2)
 * En su estado de desactivación, el cual es en el que se encuentra principalmente, tiene enlazado en la unidad α a GDP (Fig. 1)
 * NO siempre están enlazadas al receptor al cual están acopladas
 * Su función es análoga a la de GEF promoviendo que la subunidad α libere GDP y lo intercambie por GTP
 * La subunidad α es una GTPasa y una vez hidroliza su enlaze GTP a GDP se inactiva, por lo tanto el tiempo de activación esta relacionado a este evento (que es usualmente corto ya que la actividad de la GTPasa esta "enhanced" por el enlaze de la subunidad
 * Para que la subunidad α y el complejo actúen sobre un target no necesariamente tienen que separarse.
 * Si la subunidad α se enlaza a un regulador de las señales de las proteínas G (RGP) este actuará como un análogo de GAP.

Fig 3: Presenta las 3 subunidades que componen una Proteína G y el receptor al cual esta acoplada que es este caso es rhodopsin.

Activación de proteínas G medida por FRET (Fluorescence resonance energy transfer): FRET
 * Técnica dependiente de distancia utilizada para medir la interacción entre dos proteínas in vivo a distancias entre 10–100 Å.
 * Dos moléculas fluorescentes diferentes son genéticamente fusionadas a las proteínas o sub-unidades de interés.
 * Estas se acoplan de tal manera que se irradie la muestra con una longitud de onda que provoque la excitación y emisión de uno de los fluoróforos en una de las proteínas y que a su vez su frecuencia de emisión esté acoplada a la absorción del otro fluoróforo en la 2da proteina o sub-unidad de interés. En otras palabras que el espectro de emisión de la especie irradiada (1) se solape con el de absorción de la especie (2)
 * Esta emitirá energía a otra longitud de onda que nos proveerá información sobre la distancia bajo condiciones específicas entre las dos unidades.

Ver Animación: http://www.cytographica.com/animations/Cy3Cy5FRET.htm

Aplicación

Esta técnica fue aplicada para determinar experimentalmente la disociación de las subunidades de una proteína G antes de que un receptor interaccione con un ligando y después de la unión Ligando-Receptor.


 * Este estudio ayuda a demostrar la disociación de Gα y Gβγ del complejo cuando se une el ligando.
 * En la figura podemos ver que cAMP actúa como una señal extracelular que se enlaza con el GPCR.
 * En la subunidad Gα tenemos una proteína fluorescente (CFP) fusionada y en la subunidad Gβγ  tenemos fusionada otra variante de GFP conocida como (YFP).
 * Cuando CFP y YFP están cercanas, en otras palabras las subunidades Gα y Gβγ están asociadas, hay una transferencia de energía entre CFP a YFP. Esto hace que YFP emita luz amarilla.
 * Si el ligando se pega al GPCR lo activa y esto causa la disociación de la subunidad Gα y Gβγ . Esto causa que CFP y YFP estén muy separadas y que no ocurra la transferencia de energía.
 * Como se ven en la gráfica cuando cAMP se añade, a medida que pasa el tiempo la emisión de luz amarilla disminuye ya que la distancia entre una subunidad y la otra no permite la transferencia de energia.

RUTAS PARA LA TRANSDUCCIÓN DE SENALES Ruta de AMP ciclico (cAMP) como mensajero secundario

Fig. 4: Ejemplo de ruta de señales intracelulares que envuelve al mensajero secundario cAMP y al efector adenylyl cyclase.


 *  Un mensajero primario (epinefrina) se enlaza al receptor.
 *  Este sufre un cambio conformacional que promueve que GDP sea remplazado por GTP en la Proteina G
 *  La Proteína G activada provoca que el efector adenylyl cyclase (glucoproteina transmembranal) sufra un cambio es su conformación que expone el sitio de enlace de ATP. Dejando este susceptible a la catalización de ATP a cAMP (mensajero secundario). Fig 4.

Fig. 5: Transformación de ATP al mensajero secuandario (cAMP) y de cAMP hasta su forma 5-AMP por la enzima fosfodiestera
 *  cAMP actua como un activador alostérico de proteínas kinasas A (PKA).
 *  PKA activada actúa como un regulador del metabolismo celular fosforilando enzimas envueltas en las rutas metabólicas. También puede actuar en la regulación de genes específicos, secreciones celulares, permeabilidad de membrana y control de canales iónicos.
 *  cAMP fosfodiesterasa es una enzima que puede degradar cAMP a 5’AMP, lo cual terminaría con la señal amplificada. (Fig. 4)

Información adicional sobre PKA
 * Estructura de PKA

Fig 6: Imagen de la estructura PKA. La flecha de color blanco indica el sitio activo donde ocurre la adición del grupo fosfato a la proteína que va a ser fosforilada.**

Fig 7: Activación de PKA en precencia de cAMP
 * También se conocen cAMP-dependent protein kinase
 * Promueve la formación de enlaces covalentes de grupos fosfatos a la proteína blanco
 * Los fosfatos provienen del ATP que esta enlazado a PKA
 * Fosforila serinas y treoninas específicas en proteínas blanco, incluyendo proteínas efectoras.
 * Su actividad es regulada por fluctuaciones en las concentraciones de cAMP
 * Es responsable de que todas las respuestas celulares que envuelvan cAMP como segundo mensajero se lleven a cabo.
 * Es su estado inactivo PKA consiste de 4 subunidades, dos reguladoras y dos catalizadoras.
 * En las reguladoras se encuentra el los dominios en donde cAMP se enlaza
 * En las reguladoras se encuentran los dominios donde se enlaza ATP y donde esta el sitio activo.
 * El enlazamiento de cAMP a la subunidad reguladora hace que se disocie el complejo y la subunidad catalizadora se activa y fosforiliza proteínas blancos.Fig 6.

Ejemplo relacionando el aumento de las concentraciónde cAMP intracelular con la alteración de la transcripción de genes. Fig.8: Ruta para la activación de la transcripción de genes a partir de la ruta de cAMP
 * El enlazamiento de una señal extracelular al GPCR activa adenylyl cyclase vía a Gs y de esa forma aumenta la concentración de cAMP en el citosol.
 * El aumento de cAMP activa PKA y la subunidad catalítica de PKA puede entrar al núcleo donde fosforila CREB que es una proteína reguladora de genes, que reconoce la secuencia CRE (cAMP response element) que esta antes del target gene activo.
 * Luego CREB recluta a un coactivador CBP (CREB binding proteing) que estimula la trascripción de genes.


 * Ejemplo que relaciona el aumento de la síntesis de glucosa en una célula hepática por efectos de Stress via la ruta de cAMP.**
 * Epinefrina, un ligando, se pega al receptor y este activa las proteínas G.
 * Esto a su vez activa adenylyl cyclase lo cual produce cAMP.
 * Este mensajero secundario activa PKA y este como efector fosforiliza distintas enzimas que pueden fomentar la producción de glucosa directamente o degradando glucógeno.
 * La glucosa funcionaria como la fuente de energía para el “fight or flight"
 * La glucosa funcionaria como la fuente de energía para el “fight or flight"

Gαs de un receptor induce una producción grande de moléculas de cAMP.
 * Amplificadores:**
 * En la figura podemos ver que una sola molécula de epinefrina enlazada a una subunidad
 * Este cAMP a su vez activa moléculas de PKA, pero cada PKA activado fosforiliza y activa multiples moléculas.
 * Este segundo nivel de amplificación puede envolver varias reacciones en la cual los productos de una reacción activan muchas enzimas que catalizan la próxima reacción.
 * Mientras mas pasos tenga la cascada, mayor la amplificación.

• Existen diferentes tipos de toxinas que afectan las subunidade α Gs (stimulatory) y Gi (inhibitory) • **Chlorea Toxin:** • **Pertussis Toxin:**
 * Toxinas de Bacterias que afectan Gs o Gi**
 * Esta toxina, producida por la bacteria del Cholera, afecta la subunidad α de Gs, impidiendo que GTP se hidrolice. Esto causa que la Gs se mantenga activa estimulando a adenil ciclasa indefinidamente. Esto causa que las concentraciones de cAMP aumenten.
 * Este aumento en cAMP en las células epiteliales intestinales causa exceso de Cl- y agua en el intestino provocando asi diarreas severas.
 * Esta toxina, que es producida por la bacteria que causa pertussis, afecta la subunidad α de Gi, haciendo que se quede enlazada a GDP. Esto causa que Gi se mantenga apagada y sin poder impedir la función de adenil ciclasa. Esto causa que las concentraciones de cAMP aumenten. (p.640 Molecular Cell Biology 6th ed.)
 * Este aumento en cAMP en las células epiteliales del tracto respiratorio promueven la pérdida de fluido, electrolitos y secreción de la mucosidad.

• Además de adenil ciclasa, Fosfolipasa C-β es otro de los efectores importantes de los GPCRs. • Esta proteína está anclada a la membrana. • La proteína G que activa la Fosfolipasa C-β es la subunidad α Gq (también existen la Go que hace el mismo efecto, pero es activada por un receptor distinto) • La función de la Fosfolipasa C-β es convertir PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-biphosphate) en dos productos: IP3 y Diacylglycerol. PIP2 se encuentra en poca cantidad en el lado citoplasmático de la membrana.
 * Efector: Fosolipasa C**-β

IP3 es una molécula soluble en agua que rápidamente se difunde a través del citosol hasta llegar a la membrana del ER.
 * IP3**
 * Una vez llega al ER, IP3 se enlaza a unos canales que liberan Ca+2 almacenado en el ER (IP3-gated Ca+2 channels).
 * Estos canales liberan Ca+2 hacía el citosol, aumentando la concentración de Ca+2 en la célula.
 * Este Ca+2 actúa y se liga a una PKC (serine/threonine protein kinase C) haciendo que esta se mueva a la cara citosólica de la membrana plasmática.
 * Uno de los efectos del aumento en calcio es que este se asocia a PKC y provoca que esta se mueva a la membrana. (Como se explica a continuación, en la membrana se asocia con DAG).

Una vez la PKC se liga a Ca+2, a DAG y a fosfatidilserina se activa y ahora tiene la capacidad de fosforilar y activar otras proteínas.
 * Diacylglycerol (DAG)**
 * Es una molécula que se queda retenida en la membrana plasmática.
 * Esta molécula puede funcionar para transmitir otras señales como por ejemplo la producción de acido araquidónico que a su vez puede producir eicosanoides (Ej. prostaglandinas), que actúan en las respuestas de dolor e inflamación

VER ANIMACIÓN: http://entochem.tamu.edu/G-Protein/index.html
 * Ruta de PLA C**

Durante fecundación la fusión del espermatozoide con el huevo (ovocito) induce una corriente de calcio indispensable para evitar la fecundación por más de un espermatozoide, para que se complete meiosis y se inicie el desarrollo del cigoto. Se ha demostrado que la corriente de calcio se producto de la activación de canales de calcio dependientes de IP3. El espermatozoide contiene fosfolipasa z. Luego de la fusión, esta fosfolipasa es introducida en el huevo y actúa sobre la membrana del huevo, produciendo DAG e IP3 y eventualmente aumenta el calcio intracelular. Esta corriente de calcio se puede medir utilizando tintes fluorescentes sensitivos a calcio como se muestra en la figura.
 * Fecundación**

Es importante recordar que la capa citosólica de la membrana contiene el fosfolípido fosfatidilinositol en muy baja concentración. La acción de quinasas (PKI) y fosfatasas específicas sobre el grupo inositol genera derivados de este fosfolípido que están fosforilados en distintas posiciones. Las enzimas específicas que crean los derivados están reguladas o relocalizadas por señales intercelulares (GPCRs, RTKs) o procesos celulares (tráfico y fusión de vesículas en organelos específicos, endocitosis). Fosfatidilinositol y los fosfatos de fosfatidilinositol son la fuente de DAG e IP3 en las células y yambién pueden dar origen a otros mensajeros.
 * NOTA: Fosfatos de Fosfatidilinositol **

• En las células musculares, Ca+2 media la contracción del músculo. • En las células nerviosas y células secretoras, la secreción regulada requiere calcio. • PKC es dependiente de calcio para activarse y otras proteínas requieren de calcio.
 * C****a+2 como mensajero secundario**

• En la siguiente figura se observa como la interaccion de acetilcolina con el receptor GPCR activa la subunidad α de la proteína G activa que a su vez activa la Fosfolipasa C. Esta a su vez libera IP3 de PIP2 lo que hace que se libere Ca+2 del ER. Ca+2, al enlazarse a la proteína Calmodulina actúa sobre la NO sintasa, modulando la síntesis de NO. En esta cascada de señales se puede observar un ligando (acetilcolina), el efector (proteina G), y el mensajero secundario (Ca2+/Calmodulina).

• Estas funciones de Ca+2 pueden llevarse a cabo ya que la concentración de calcio dentro de la célula está muy bien regulada.
 * La concentración de Ca+2 en el citosol son bajas.
 * Esto es causado por diferentes mecanismos:
 * Bomba de Ca+2
 * Na+-driven Ca+2 exchanger
 * Bomba de Ca+2 en el ER
 * Ca+2 binding molecules en el citoplasma
 * Importe activo de Ca+2 a las mitocondrias

Calcio/Calmodulina
 * Calmodulina es una proteina que requiere calcio para activarse. La funcion de calmodulina/Ca2+ es adherirse y activar otras proteinas target para alterar su actividad. En algunos casos el complejo cambia su conformacion y se adhiere a una enzima. luego de separarse del complejo la enzima se puede autofosforilar sin la necesidad de la asociacion.
 * Calcio tiene varias funciones de regulacion en el organismo como por ejemplo regula la exositosis de neurotransmisores ya que los snares responden a calcio y hace que la membrana de la vesicula y la plasmatica se fusionen.


 * Terminación de la Cascada de GPCR**
 * 1) Ligando no está enlazado.Existen mecanismos para eliminarlo.
 * 2) Galpha tiene acción de GTPasa (acelerado por GAPs).
 * 3) Proteínas que se activaron mediante fosforilación, son defosforiladas por fosfatasas. (Switch molecular).
 * 4) Cuando la célula es expuesta a una concentración alta de ligando por un largo período de tiempo, los receptores se pueden saturar y "desensitisized" (o adaptado) y perderia la capacidad de responder a la presencia del ligando
 * Inactivando el receptor (desensitización)→ son alterados para que no interaccionen con proteína G (fosforilación u enlace de proteínas inhibidoras). GPCR Kinasase (GRKs) fosforilan dominios citosólicos en los receptores activos.
 * "Receptor Sequestration” → el receptor fosforilado liga arrestina, la cual: 1. previene que el receptor activo interactue con la proteina G 2. comienza a reclutar adaptor proteins (AP) para llevar a cabo endocitosis por medio de clatrina, resultando en su endocitosis. Pueden ser internalizados por algún tiempo para que no tengan acceso al ligando o pueden ser internalizados.
 * “Receptor down-regulation” → se degradan en lisosomas después de ser internalizados