8.+Sorteo+de+Proteinas



I. Tipos de Proteínas
====-Las proteinas se comienzan a sintetizar desde el citoplasma pero cada una puede permanecer en el citosol o localizarse en organelos diferentes dependiendo de las sen~ales que tenga (nucleo, mitocondria etc). El sorteo que ubica a cada una de las nuevas proteinas se divide en 3 tipos: ==== = = -La especifidad de los organelos en la celula esta dada por una funcion especifica de proteinas membranales, el compartimiento interior y lipidos. Sintesis de proteinas: Traduccion en el citoplasma (ej.glucolisis,citoesqueleto y microtubulos) Sintesis en organelos (ej. dirigidas a mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas)
 *  "gated": se refiere a las proteinas que se mueven del citosol al nucleo atraves de complejos de poros nucleares que se encuentran en la envoltura nuclear. Transportan activamente macromoleculas especificas y a las moleculas pequeñas por medio de difusión.
 * transmembranal: se refiere a las proteinas que van al reticulo endoplasmico, mitocondrias, perixosoma etc. Atraviesa la membrana.
 * vesicular: se refiere a las proteinas que se transportan en vesiculas para ser secretadas al exterior de la celula. Tienen que ser compartimientos topologicamente equivalentes para que ocurra el transporte.

Métodos de estudio
====- Para ver la ruta de las proteinas dentro de la celula cabe mencionar el experimento pulse-chase, en el que se incorporaron amino acidos reactivos a proteinas en el proceso de sintesis y depende del momento en que se anaden marcan una parte en especifico. Luego ese pulso se quita y se ponen AA sin radioactividad y se permite a la proteina que siga sintetizando. Mediante este estudio se logro ver que las protinas se marcaban en el RE rugoso y luego en el aparato de Golgi, luego vesiculas etc. ==== ====Las celulas del pancreas se utilizan para estudio de celulas secretoras ya que se puede observar que hay polaridad en los organelos y que la celula tiene un orden. ==== ====-Para estudiar los componentes celulares individualmente es necesario aislarlos, y esto se logra mediante un proceso llamado centrifugacion. Para purificar los organelos existen 2 metodos: ====
 * 1) centrifugacion deiferencial: la misma se basa en la utilizacion de una herramienta similar a un "food blender". Se toma el tejido homogeneamente, y para aislar los componentes especificos se va aumentando la velocidad de la herramienta sobre el tejido. Se deja llevar por el peso del organelo, al final el tejido con el peso seleccionado se queda en la parte de abajo en forma de precipitado.
 * 2) centrifugacion por gradiente de densidad: Se construye un gradiente usando una solucion de sucrosa y la muestra del tejido se pone en la parte de arriba de la solucion y cada organelo procede a acomodarse u ordenarse en la densidad que le corresponde.
 * A partir de estos métodos de separación se pueden aislar microsomas (pedacitos del retículo endoplásmico homogeneizados, como si fueran vesículas) para estudiar la función del retículo endoplásmico en sitemas libres de células.
 * en los microsomas estan las proteinas membranales que se nesecitan para introducir las proteinas al ER, traslocón, peptidasa.

En el reticulo endoplasmico ocurren varios procesos, entre estos estan:

a) sintesis de proteinas secretadas b) puentes de azufre c) glucosilacion d) la proteina adquiere su estructura funcional

Tambien las proteinas que salen del riticulo endoplasmatico rugoso salen de la parte transicional y debemos saber que tenemos diferencias estructurales y funcionales en los varios tipo de ER.

Hipótesis de la secuencia señal:

 * La hipotesis de la secuencia señal se puede ver por medio de sistemas de sisntesis de proteinas libres de celulas. Se traduce la proteina con su secuencia señal y al añadir microsomas se observa que la señal sigue, esto quiere decir que no se incorporo al microsoma y no se corto la señal. Si se hace co-translacion la proteina entra al microsoma y la señal es cortada por la peptidasa. Al la proteina tener menos amino acidos quiere decir que fue introducida al microsoma por co-translacion ya que la señal guio el reconocimiento por el SRP permitiendo la introducion de la misma al microsoma y despues esta señal es cortada, permitiendo que la proteina madure en el lumen.
 * //*co-translational//---significa que la translocacion de las proteinas es un proceso que ocurre mientras se sintetiza el polipeptido. Es decir, las proteinas comienzan a ser importadas al lumen del ER antes que se sitetizen completamente.
 * los ribosomas que participan en la translocacion de proteinas al ER son iguales a los ribosomas solubles en el citosol---lo que determina si se pega el ribosoma al ER es la secuencia señ al en la proteina que se traduce.

====Componentes del sistema de transporte - El transporte puede ser gatillado. Se observa para las proteinas que entran y salen por los poros del nucleo. Puede ser un transporte transmembranal. El otro es el transporte vesicular (a traves de vesiculas). ==== ====- Las proteinas se transportan en ribosomas y aunque todos son iguales hay algunos que necesitan pegarse al RE para permitirle a la proteina que se siga sintetizando. En este proceso participan varios componentes.==== .
 * 1) SRP (particula que reconoce el "signal sequence": tiene RNA y polipeptidos entre otros. La misma se liga instantaneamente al ribosoma que va transportanto el signal sequence ya que tiene gran afinidad con este.
 * 2) Receptor de SRP: el mismo se encuentra en el ER y se encarga de reconocer la SRP y pegarlo al translocon.
 * 3) translocon: es el que finalmente recibe el signal sequence de la proteina para que la misma continue con su sintesis en el RE, dejando asi que la SRP y el receptor de disocien para ser reciclados. El mismo es abierto por el signal sequence y puede seguir con la traduccion ya que el mismo esta pegado, en este sistema tambien participa la peptidadasa.

Proteína destinada al lumen del ER

 * Las proteinas tiene una secuencia de retención que las mantiene en el organelo donde la señal es reconocida. Esta señal es cortada por la peptidasa y degradada. La proteina naciente va al lumen del ER donde madura. Sino esta la peptidasa de la secuencia señal la misma se queda en la membrana, ya que es hidrofobica impidiendo la degredacion de la misma. Las proteínas que son solubles en agua son translocadas al lumen del ER, donde son preparadas para ser secretadas o para ser dirigidas al lumen de otro organelo.

Proteínas destinadas a la membrana del ER

 * Estas proteinas que estan destinadas a la membrana del ER tienen una "signal sequence" que es hidrofobica. Esta señal es reconocida por el SRP obliga a la proteina a ser traslocada. Ademas tienen otras señales como la STA (Stop transfer anchor) y la SA (Signal anchor) que define la topologia de la proteina.
 * Tipo I: La secuencia señal dirige la maquinaria ya que esta esta en el terminal amino. Cuando el SRP se pega al ribosoma y es reconocida por su receptor en la membrana la proteina naciente va al traslocon para continuar su traduccion. La secuencia señal es cortada por la peptidasa y al traslocon reconocer la STA queda el terminal N hacia el lumen y el terminal C hacia el citosol.
 * Tipo II: No tiene secuencia señal sino una secuencia interna de amino acidos positivos seguidos por aminoacidos hidrofobicos. Esta permite su reconocimiento y es llevada al translocon. El SA se mantiene en la membrana, el terminal C se encuentra en el lumen y el terminal N en la membrana. La traduccion empieza en el citosol hasta que llega a la señal y ahi es reconocida por el SRP, por ende tiene que estar desenrollada. Cuando el SRP se pega al ribosoma se para la traduccion, obligando a la proteina a ser traslocada. La profesora también había señalado que la forma en la cual una proteina es anclada a la membrana del ER depende las cargas de amino ácidos alrededor del "signal anchor (SA)"-- se ha encontrado que las cargas positivas alrededor del SA son orientadas en el citosol, las negativas, en el lumen.

Proteína alcanza conformación correcta

 * //La conformacion correcta de las proteinas se alcanza por la union de un oligosacarido al amino acido Asparagina. Este complejo de azucar y proteina permite que se estabilize la estructura de la proteina y que se doble correctamente. Para verificar si la proteina esta correctamenta doblada se pasa por un "quality control" en el ER. Este ciclo incluye glucosilaciones y "glucose trimming" hasta que la calnexina reconoce que solo hay una glucosa, la corta y la proteina se queda solo con el oligosacarido unido, lo que indica una proteina lista y correctamente doblada para salir del ER. Otras chaperonas evaluan este proceso y permiten el ambiente adecuado para que la proteina se configure. Si la proteina sigue doblada incorrectamente se dirige una sistema de degradacion llamado proteasoma. Al pasar esto se mandan mensajes al nucleo para la produccion de chaperonas que ayuden directamente a la proteina a doblarse de la manera adecuada.//

=Glucosilaciones =
 * Entre las señales que indican que una proteína no está correctamente doblada se encuentran el que estas tengan residuo de azúcar, con lo cual indica que a esta proteína le falta procesamiento.


 * Puentes dislfuro **
 * la formacion de puentes de disulfuro es muy importante para que las proteinas adquieran su forma funcional, para esto hay proteinas residentes del ER como la PDI que tiene como funcion la oxidacion de SH libres en cisteínas para formar puentes de disulfuros.

<span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">
=<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 13px; font-weight: normal; line-height: 19px;">Entre las chaperones hay dos tipos bajo los cuales se pueden clasficar, las //chaperonas moleculares// evitan que las proteínas adquieran una configuración, esto debido a que si se "fold" pueden evitar que secuencias con funciones se lean lo cual terminaría impidiendo que estas puedan llegar a tener su forma 3D funcional. Las //chaperoninas// por otro lado se encargan de facilitar el que estas se doblen y adquiran su forma funcional. Para activar a las chaperonas la proteina envia señales que llevan finalmente a la expresion de genes que codifican para las chaperones las cuales son transportadas hacia el lugar donde s encuentre la proteina y poder interectuar con esta. = =<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 13px; font-weight: normal; line-height: 19px;">Entre las chaperonas que estudiamos se encuentran //calreticuli// y //calnexin// (una trabaja con proteinas solubles y la otra con proteinas dirigidas a la membrana.) Basicamente, como dice anteriormente, estas ayudan a determinar cuando la proteina esta en su configuracion funcional y cuando esta lista para salir del ER; usando el N-linked oligosaccharide que se puso en la proteina durante la glucosilacion. =

<span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">Manejo de proteínas cuya conformación no es correcta

Cuando una proteina lleva mucho tiempo trantando de adquirir su configuracion personal pero no lo logra la misma debe ser exportada del ER y degradada en el citosol. Este mecanismo se conoce como dislocation o retrotranslocation. Reconocer que proteina no ha logrado obtener su configuracion adecuada en un tiempo largo no es sencillo y, una vez mas, se usa el N-linked oligosaccharide para ayudar a reconcer estas proteinas. El mismo funciona como un "timer" de cuanto tiempo una proteina ha estado en el ER. Cuando una proteina con una configuracion incorrecta se detecta, la misma selleva al citosol, es "deglycosylated", "ubiquitylated" (lo cual significa que se modifica esta proteina a~adiendole ubiquitin) y se envian a proteosomas que degradan la misma. (Figura 12-54 del libro de Alberts.)

Se debe conocer tambien que cuando hay una acumulacion de proteinas con configuracion incorrecta se inicia un "unfolded protein response" en el ER lo cual aumenta la cantidad de chaperonas y de proteinas que ayuden en el proceso de "folding" en el ER, tambien aumenta el numero de proteinas envueltas en la retrotranslocacion y de proteinas encargadas de la degradacion en el citosol.

<span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">III. Otros organelo
=<span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">Núcleo = El núcleo es una estructura compleja. Hay un gran flujo de moléculas que tienen que moverse hacia el núcleo. <span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;"> <span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;"> <span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">
 * Este est<span style="font-family: 'Calibri','sans-serif'; font-size: 11pt; line-height: 115%; mso-ansi-language: ES-PR; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-family: 'Times New Roman'; mso-bidi-language: AR-SA; mso-bidi-theme-font: minor-bidi; mso-fareast-font-family: Calibri; mso-fareast-language: EN-US; mso-fareast-theme-font: minor-latin; mso-hansi-theme-font: minor-latin;">á rodeado por 2 membranas que componen la envoltura nuclear (1 exterior & 1 interior). La membrana externa es contínua con el retículo endoplasmático rugoso. La lámina nuclear le brinda soporte estructural a la envoltura nuclear.
 * La envoltura nuclear es de 20-40nm. Hay ybas regiones donde se definen los poros nucleares por donde se mueven macromoléculas que tienen que salir al citoplasma para llevar a cabo su función. Hay sustancias que se sintetisan en el citosol y tienen que regresar al núcleo. También hay moléculas pequeñas que se mueven a travez de los poros.
 * El complejo nuclear del poro: tiene un tamaño de 125 millones de dalton y una velocidad de transporte extraordinaria de 500 macromoléculas por segundo. El poro atraviesa la envoltura nuclear y se extienden unas estructuras bien importantes (las fibrillas) hacia el citoplasma y hacia el interior (forman como una canasta).
 * En este organelo, las nucleoporinas son los poros por los cuales transitan macromoléculas en ambas direcciones. Estas nucleoporinas atraviesan la membrana nuclear.<span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">

= = = = <span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;"> i. Secuencia señal ii. Componentes del transporte
 * Ejemplos de algunas que son importadas hacia el núcleo: histonas y nucleosomas.
 * Ejemplos de algunas que son exportadas hacia el citosol: mRNA
 * Tienen un poro de tamaño grande, 120 nm pero en el interior del poro las proteinas tienen prolongaciones en este que reducen el espacio del mismo a aproximadamente 9 nm, limitando la entrada de macromoleculas de mayor tamaño <span style="color: black; font-family: 'Arial','sans-serif'; font-size: 10pt;">por difusión (permite movimiento por difusion a partículas de tamaño < 10 nm)
 * En este organelo las nucleoporinas son los poros por los cuales va el trafico en ambas direcciones de macromoleculas.
 * Moleculas grandes que necesiten entrar al nucleo utilizan transportandores, estos transportadores tinen afinidad para los FG- Proteins, lo cual son proteinas dentro del poro nuclear.
 * Secuencia para el movimiento hacia el nucleo es rica en Lys; además esta no nesecita estar en el principio del polipéptido. La secuencia está hacia el terminal carboxilo y tiene un aminoácido conservado que tiene (Lys-Lys-Lys-Arg-Lys)- secuencia de importación hacia el núcleo. Si incorporo en el terminal carboxilo la secuencia de localización nuclear a una proteína citosólica, ésta se dirigirá hacia el núcleo.
 * Su descubrimiento fue a traves del uso del mecanismo de infeccion de los viruses, utlizando mutaciones de punto y tecnicas de floresencia.
 * el transporte tiene afinidad por las secuencias FG- repeats que están compuestas de Fenilanilina y Glicina.
 * el movimiento de "nuclear import" en el núcleo a traves de los poros estan movido por la presencia de gradientes de concentración de Ran-GDP alto en el citosol y Ran-GTP en el nucleoplasma. Por la afinidad que tiene el trasporte( nuclar import receptor) entrando por el Ran- GDP entra con este, como una especie de __symporte__ (no atado al mismo), donde luego de entrar al núcleo y depositar el cargo este, el trasportador, gana afinidad por el Ran-GTP cuyo gradiente lo mueve hacia el citosol donde se disocia del GTP que se defosforila y pasa a ser Ran-GPP otra vez.
 * Enzimas importantes: //Ran-GAP// (defosforila Ran-GTP) [citoplasma] y //Ran-GEF// (fosforila Ran-GDP) [nucleoplasma]