10.+Trafico+de+proteinas+II

**Transporte vesicular del RE al complejo de Golgi** - La estructura de golgi tiene compartimientos

-ERGIC es un compartimiento intermediario del aparato de Golgi entre el RE y Golgi. -Le sigue a ERGIC la red Cis Golgi Network. Este recibe las vesículas que provienen de ERGIC.

Algunas proteínas residentes del ER se escapan en las vesículas de transporte hacia el Golgi. Estas son regresadas por un transporte retrógrado. Las proteínas residentes tienen secuencias señales:  -Dependiendo del pH el receptor se liga o no se liga a la señal o RE tiene un pH mayor y el Golgi tiene un pH menor o El pH modifica la afinidad del receptor por la secuencia señal.
 * Movimiento Retrogado de Vesiculas (Golgi-ER)**
 * 1) proteínas del lumen -KKXX (Lys-Lys-xx)
 * 2) proteínas membranales - KDEL

-Experimentos que se pueden realizar para probar esto:  El compartimento ERGIC es importante en el proceso de regresar las proteínas del ER. Las vesículas COPI pueden originarse de este compartimiento. COPI se forman mediante el mismo mecanismo que COPII pero su función es devolver moléculas al retículo endoplasmático.
 * Subirle el pH al compartimiento (Golgi) y no se debe pegar (KDEL) al receptor
 * Mutación al peptido y se debe quedar en el Golgi
 * Ponerle KDEL a otra proteína y sesupone que se valla pero se queda en el retículo

- Microscopía electrónica: //Camillo Golgi// descubre el golgi como un organelo formal haciendo tinciones del sistema central (nervioso). Trataba los tejidos con metales. - Microscopia confocal: sacan imágenes tridimensionales y le ven los compartimientos específicos del Golgi - Golgi: está hecho de cisternas(compartimientos separados) 
 * Aparato de Golgi**
 *  Red Cis
 * Cisterna Cis
 * Cisternas Mediales
 * Cisternas Trans
 * Red Trans

- Golgi en algunas células está polarizado - Células Goblet (caliciformes): el aparato de golgi es importante. Tiene muchas vesiculas, hay una polarizacion del organelo, salen por la parte apical - Golgi está anclado al citoesqueleto - Funciones del Golgi: o Distribuye o Empaca o Modifica los N-linked oligosacáridos o Fosforilación de oligosacáridos lisosomales o Modifica péptidos como insulina, rompiéndola en subunidades o Glucosilación de tipo O-linked o Sulfación de residuos de tirosina

- Cada compartimiento (cis, medial, trans) tiene una composición especifica de enzimas por lo cual si yo marco estas proteínas pues se marcaran distintos compartimientos del Golgi. Se puede marcar selectivamente la cara Cis, Medial o trans conociendo sus enzimas. - Enzimas que glucosilación: Transferasas de azúcares (glucosiltranferasas) -G lucosidasas - modifica azucares a esos andamios o Las azúcares son tan importantes que más de 1% del genoma son para glucosilación o No todas las células tienen las mismas azúcares (son altamente reguladas) o La expresión de enzimas son altamente reguladas

- Hay una herramienta que te dice en qué etapa está la proteína en su procesamiento: tiene que ver con el proceso de N-linked oligosacáridos - Las azúcares servían (en el ER) como señal para ver si las proteínas están bien dobladas: Control de calidad de la proteína - Azúcares tipo O: el azúcar se enlaza al grupo OH(amino ácidos como serina o treonina) - Las azúcares son importantes porque se le puede dar seguimiento desde que van desde el RE al golgi y se puede extraer la proteína corriendo una gelatina y dependiendo en la forma en que corre la gelatina se puede determinar si está procesada o no


 * Una de las formas en que se ha podido estudiar es a través de levaduras, se estudia las modificaciones que ocurren al oligosacarido que se le añade a la proteina o a los lípidos.

En la clase observamos una mutación que es dependiente de la temperatura que a unas temperaturas mas altas se expresa. (esto se podía observar en la gráfica) Todo depende de como se estudie la azúcar, como se estudie las modificaciones de los oligosacaridos y si este es sensible a una enzima. Existen diferentes enzimas que se pueden usar para modificar los oligosacaridos y puedo clasificar las azucares basado en que son sensitivas o no a esa enzima. En la grafica de la clase la enzima utilizada era una //endoglucosidasa D//, cuando esta es procesada en el ER la azucar no es sensitiva a la enzima en cambio cuando se procesan en el cis-golgi si es sensitiva. Esto se puede utilizar para determinar si tengo mutantes en el trafico de proteinas, definir donde se queda atrapada la proteina y decidir cual es la maquinaria afectada.

En la grafica se observa una curva de crecimiento normal de la levadura 32°C (azul) y una 40°C (roja) con el procesamiento normal de tener una azucar que.no es sensitiva a una sensitiva. Nos demuestra que la sensitividad a //endoglycosidasa D// aumenta a medida q pasa el tiempo, porque al evaluar como corre las azucares se puede observar que comienzan siendo resistentes, luego menos resistentes hasta ser sensitvo. Por lo tanto la curva representa en que compartimiento esta siendo procesado la proteina (ER-resistente luego Golgi-sensitivo). La grafica representa el proceamiento de las azucares normalmente. Las azucares que se utilizan para estos experimentos son producto de bacterias que sirven de herramientas de investigacion como los anticuerpos.Me identifican como esta siendo procesado esa azucar.


 * Modelos de Transporte**

- Modelo vesicular: Movimiento del RE al golgi es a través de vesículas; las vesículas van pasando de cisterna en cisterna. Cada vesícula tiene una composición específica de proteína. - Modelo maduración de la cisterna: la vesícula no se está moviendo de un comportamiento a otro sino que la cisterna tiene una producción de madurez (que van madurando). La cisterna cis se convierte en medial y luego en trans, movimiento de una cisterna a otra. Síntesis de proteínas grandes. No va a estar en vesícula.

Para probar el modelo de la maduración de cisternas se utilizan métodos de marcaje de fluorescencia en levaduras se marcan componentes del golgi en verde : proteínas residentes en la cisterna temprana del golgi (cis); marcada con GFP rojo : proteínas residentes en las cisternas tardías del golgi; marcada con variante de GFP *la célula esta viva para poder seguir la madurez de las cisternas

En las primeras 3 fotos se puede observar verde solamente (donde señala la flecha) y en las ultimas 3 solo rojo, pero la foto del medio es (verde y rojo) amarilla; esto quiere decir que en el mismo compartimiento tengo proteínas con GFP y el variante rojo.Siguiendo un mismo compartimento observando la expresión de proteínas que se supone que estén únicamente en la cisterna temprana o en la cisterna tardía se pueden ver expresadas a la vez. Demostrando el proceso de maduración de cisterna ya que si fuera el vesicular siempre estaría o rojo o verde, no un color mezclado como el que aparece en la cuarta foto. Este experimento apoya al modelo de maduración de las cisternas.


 * Movimiento de vesículas saliendo del Golgi-trans**

-secreción regulada= vesículas secretoras que se van a fusionar con la membrana plasmática de forma regulada. Ejemplo: sinapsis -secreción constitutiva= secreción que está ocurriendo continuamente. Ejemplo: vesículas que llevan proteínas que son partes de la matriz extracelular.

Vesiculas cubiertas por clatrina salen del trans-golgi cubiertas por doble capa de proteína; capa externa tiene a la proteína fibrosa clatrina (tiene como 3 patitas). Cada patita tiene una cadena liviana y pesada, estas espontáneamente forman una caja compuesta de polígonos; diferentes cantidades de clatrina dan origen a estas cajas. -En las membranas se encuentra lo necesario para ensamblar ciertas proteínas. Como por ejemplo la vesícula necesita otras proteínas para "pinch off" Dinamina puede estar dirigida a una membranas especificas porque las membranas están enriquecidas con inositoles fosfatos específicos. Especificidad de composición de lípidos en la membrana y las proteínas involucradas en el trafico vesicular afines a los inositoles fosfatos.
 * En la parte externa tienen clatrina que son proteínas que ayudan a formar la vesícula y en la interna pueden tener complejos de AP (AP1,AP2,AP3) y otras que ayudan a concentrar el cargo que es especifico.
 * dynamina = proteina que requiere del hidrólisis de GTP para favorecer que la vesícula salga, recluta cargos específicos y distorsiona la membrana

Organelos que contiene enzimas hidrolíticas (hidrolasas acidicas). Su pH es bajo y contienen una bomba tipo V, la cual es H+ pump. Esta bomba estabiliza el pH bajo. Los lisosomas se encargan de la digestión intracelular. El estudio de los lisosomas es importante porque hay enfermedades que tienen que ver con la deficiencia de los lisosomas en degradar macromolecuals y esto lleva a que estas se acumulen, tambien afecta el desarrollo del sistema nervioso.
 * Lisosomas**

-Formación de vesículas que van a dar origen a los lisosomas. Para poder saber cuales son las vesiculas que contienen enzimas lisosomales, se debe observar si estas contienen manosa 6-fosfato (M6P). Estas vesiculas contienen una cadena de oligosacarido enlazado a M6P en terminal N. Las enzimas lisosomales tienen un signal patch, el cual hace que dos enzimas GlcNAc-fosfotranferasa y fosfodiesterasa a~adan el grupo M6P a las enzimas lisosomales. En este proceso se le a~ade un grupo fosfato a manosa y ocurre en el aparato de Golgi. Luego, al tener ya la enzima lisosomal con el grupo M6P estos son reconocido por el receptor de M6P que se encuentra en el trans Golgi y se forma la vesicula. Esta vesicula esta cubierta de clatrina. En esta etapa todavia no es un lisosoma. En algun momento la cubierta de clatrina se disocia (la vesicula se "desnuda").

La vesicula entra a un "late endosome". Al suceder esto el pH es modificados con las bombas Tipo V. El lisosoma (inactivo todavia) se disocia del receptor de M6P en un pH bajo, y estos receptores son reciclados y van hacia el Golgi. El "lisosoma" (zimogeno) que se encontraba en la vesicula es activado por otros lisosomas. En este procedimiento es bien importante la bomba de protones que es una proteina transmembranal. Enzimas GlcNAc-fosfotransferasa y fosfodiesterasa a~adiendo el grupo fosfato a manosa.

-Endocitosis: Es un proceso en el cual material extracelular es ingerido hacia el area intracelular. Esto es posible por medio de una vesicula que se forma en la membrana.