La clase de hoy 1 de septiembre fue dada por el Dr. Lasalde y fue en relación a los canales de membrana...
Comenzó dando un breve "insight" de la historia detrás de el conocimiento presente de las membranas y sus canales. Para medir una diferencia en potencial de membrana se necesita un instrumento especifico para hacerlo, por lo cual no es hasta que esta tecnología surge. Los canales iónicos se estudian por medio de la electrofisiologia. Para los a~os 60 se hacían registros análogos. Amplificador operacional es el instrumento por el cual se hace este análisis y fue creado en Inglaterra como instrumento de defensa en la Segunda Guerra Mundial y esto cambio la electrofisiologia.
  • Conceptos básicos de canales ionicos :
  • Iones siempre pasan a favor de un gradiente de concentracion en condiciones fisiologicas
Transporte: Que cantidad de iones por tiempo puede transportar ATPasa Na/K: 100 por segundo Que cantidad es transportada por un canal ionico? 10 millones por segundo O sea 100mil veces mas rapido que un transportador pasivo o una dependiente de energia, como la ATPasa.
El por que se supo cuando se pudieron clonar los canales. Antes se podian medir las corrientes electricas pero no se sabia que determinaba la selectividad del poro. El filtro por donde pasan los cationes tiene que tener algo que dicte la selectividad. Por ejemplo la selectividad que existe de los poros respectivamente pertenecientes a transportar Na o K. Ambos son inones de carga negativa, como un canal los distingue? Como deja el paso de iones tan rapidamente? Los clonos de canales ionicos aparecen en los 80 para poder explicar este fenomeno. Por analisis de hidrofobicidad predecian dominios de los canales y cuales podrian formar el poro por donde pasan los iones. Se combinaron varias tecnicas para estudiar los canales. Tecnicas moleculares. Se extrae el RNA o se sintetiza a partir del DNA, se inyecta en ovocitos (Xenopus laevis), el ovocito lo traduce y lo incorpora en su membrana. De esta forma se podia estudiar las caracteristicas electricas. Se podian generar canales con mutaciones de punto para ver como se afectaba sun funcion. Por ejemplo, si los cientificos habian predicho que un residuo de a. glutamico era importante en el poro y este se mutaba, se creaba un canal mutado y se estudiaba el efecto de la mutacion en sus caracteristicas electricas. Los avances en el campo de la biologia molecular permitieron mas adelante producir canales ionicos en grandes cantidades en organismos modelos. Esto facilito su purificacion y cristalizacion. Mediante difraccion por rayos X es que se determina la estructura tridimensional del canal y se crean modelos para explicar la funcion.

Canales Iónicos
  • Tienen selectividad a un ion en especifico.
  • Mucho mas rapido que los transportadores.
  • Tienen un poro (ambiente polar) y el filtro selectivo dentro del poro tiene amino ácidos especificos que seleccionan que va a entrar y que no.
  • Los iones no pasan hidratados, al pasar por el poro, son deshidratdos. Este proceso es bien especifico.
  • Canales se dividen según la forman en que son gatillados ("gated")
1. Voltaje - abren en respuesta a cambios en el voltaje de la membrana (ejemplos: Canal de Sodio, Potasio, responsables del potencial de accion..)
2. Ligando- al pegarse el ligando se abre y luego que no esta el ligando se cierra (ejemplos: Receptor de acetilcolina, nicotinico)
3. Mecánico- puede ser activado mecánicamente, un ejemplo por cambio de temperatura, o estiramiento de la membrana
4. "Leak channels" - Este tipo de canal abre y cierra espontaneamente (ejemplo: Canales de Potasio, sodio, cloruro responsables del potencial de membrana)

Siguen apareciendo canales mientras se continúan las investigaciones

Potencial de membrana

El potencial de membrana surge cuando hay una diferencia de cargas electricas en ambos lados de la membrana, a causa de un exceso de iones positivos en un lado de la membrana y de iones negativos al otro lado de la membrana.
El área extracelular es rica en Na+ y Cl-, mientras que el área intracelular es rica en K+ y diversos aniones órganicos definidos como A-.

Este gradiente en la membrana se debe a 2 cosas:

1. Gradiente creado por bomba de Na+ y K+ (electrogenica)

-El sodio esta en mayor cantidad en el exterior por lo tanto entra, el potasio esta a mayor cantidad interior y por eso sale.

La bomba de sodio/potasio saca 3 sodios y entra 2 potasios.
  • El movimiento es de 100-500 partículas por segundo dependiendo de la cantidad de potasio que se encuentre adentro. Ya que si hay mayor potasio el movimiento va ser mas lento.

  • Mecanismo complejo porque la cantidad de carga no es fácil de normalizar.

  • Es electrogenica lo cual se refiere que hay proceso de 1 carga en cada ciclo pero la dificultad es que es bien pequeña para medir por lo tanto el mecanismo que tenemos es hipotético.

Permeabilidad

-Depende de los canales de "liqueo" que tenga la membrana.
-Las membranas usualmente tienen mayor cantidad de canales de potasio, por lo tanto son mas permeables a potasio.

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=

Igual balance de masa en terminos de cationes y aniones significa que el potencial de membrana es cero.

?Como se forma el potencial de membrana?

Existe un gradiente electroquimico para potasio, la concentracion es mayor intracelularmente. El potasio sale a favor de su gradiente quimico y eventualmente es "retenido" por su gradiente electrico, al salir deja su contra ion al otro lado de la membrana y en el interior de la membrana queda negativo. Cuando ambos gradientes estan en equilibrio el potasio no se mueve mas. Se describe este comportamiento matematicamente con la ecuacion de Nernst. En condiciones experimentales el potencial va a estar en -60V calculandolo tomando en consideracion solamente la permeabilidad para potasio.

  • El "resting potential" de la membrana depende de todos los iones que esten en movimiento o esten presentes (canales que tenga la membrana).

  • Cuando el potencial de membrana se encuentra en su valor de reposo, los canales de sodio y potasio, dependientes del voltaje están cerrados.
  • Potencial de reversion
    • El potencial de reversion es especifico para cada canal ionico y depende de las concentraciones del ion extra e intracelular. Es el potencial en el cual no hay movimiento del ion, el gradiente electroquimico esta en equilibrio. Por ejemplo: Si hacemos un experimento en donde hay igual concentracion de ion adentro y afuera el potencial de reversion sera igual a 0. Utilizando las concentraciones que existen normalmente de potasio, y dependiendo del canal que estemos estudiando, los potanciales de reversion de potasio pueden estar entre -60mV y -70mV.

    • Tenemos mas canales de K por lo cual el "resting potential" y el "reverse potential" son bien similares.

    • Canales ionicos tienen potenciales de reversion distintos por lo cual el identificar el potencial de reversion dentro de una celula indica entonces la presencia los canales que tiene esa celula.
    • El movimiento de iones se puede medir con la ecuacion basica de q=cV .

Midiendo el Potencial de membrana

-Si un amplificador lee -80V se debe a que en este caso:

  • Externo: K= 25, Na=125, Cl=130
  • Interno: Na=7, K=135 ,Cl=11

?Como cambia el potencial si se alteran las concentraciones de iones?

Si se añade Na externamente no hay cambio, la línea en una grafica seria lineal. En cambio si añado K exterior el potencial se vuelve menos negativo, ya que la célula se esta despolarizando. Todas las células que estén alrededor se van a despolarizar.

-Si tengo K exterior alto la célula se excita inapropiadamente.

Caso Clínico

Accidente tengo lesión muscular, las células se rompen y sale el K, esto hace que la célula se depolarize y afecta la señal que transmite el mensaje de contracción.


- Si una persona se encuentra en Hipoxia es porque el oxigeno baja afectando al cadena de transporte electrónico y si se afecta no se produce ATP y las bombas de Sodio y potasio se ven igualmente afectadas ya que necesitan el ATP para poder funcionar.

- Célula opera como circuito, el canal de Na y K puede regular la secreción de insulina en el páncreas. Hay mutaciones especificas en el canal iónico que afectan el potencial de membrana que a su vez tienen un efecto en la secreción de insulina.

¿Cómo saber que una enfermedad/sintomas surgen por canales ionicos que presentan mutaciones?

-Utilizando sangre, luego se secuencia el genoma y con la ayuda de primers encuentro la mutación, con ese DNA se reproducen in Vitro y luego se mida su funcionalidad.

-Una manera de medir funcionalidad es por medio del uso de ovocitos de rana. Se inyecta al núcleo o se sintetiza el mensajero y se inyecta al citoplasma, se caracteriza para saber si es ganancia o pérdida de función.

-Para los años 80 Miledi inyecta en el núcleo del ovocito y ayuda a entender mejor los canales iónicos y así poder entender mejor como tratar una enfermedad.

- Al hacer diferentes estudios se encuentran con problemas en las proteínas membranales ya que al purificarlas y caracterizarlas, se encuentran con que son muy pequeños los cristales que forman y hay muchas que están truncadas(faltan pedazos) por eso seria necesario construir un transgénico animal con la mutación para probar el tratamiento.