CANALES IÓNICOS

Los canales iónicos se pueden estudiar por medio de :
  • Bioquímica: "radioactive ion flux", "drug binding"
  • Biología Molecular: secuenciando, clonando, modelos transgenicos, mutagenesis, etc..
  • Biología estructural: microscopía, cristalografía y NMR
  • Electrofisiología


- Para detectar canales iónicos se utilizan distintos métodos electrofisiológicos:

*Patch-Clamp (Neher-Sakmann Premio Nobel 1991)
~ Neher y Sakmann lograron aislar un solo canal iónico luego de estar años limpiando la superficie de la célula para crear una especie de "sello". Parte del éxito de la técnica de Patch Clamp se debe a las adaptaciones que se hicieron el electrodo para lograr la formación de un sello de alta resistencia conocido como gigasello. Notaron que al hacer succión, el ruido de Johnson (ruido termal causado por el movimiento de particulas) que estaban analizando en realidad estaba transimiendo la actividad dentro de un canal iónico.
~ El sello tiene que ser sin fuga de corriente para obtener una medida precisa.
~ Lo mas importante es que esta tecnica mide la conductancia unitaria. Cada canal ionico tiene una conductancia unitaria especifica para cada tipo.
~ Ejemplo:
~Si estamos estudiando la conductancia del canal del receptor de acetilcolina. Podemos poner acetilcolina en la pipeta a distintas concentraciones. Cuando hay alta concentracion de acetilcolina, el receptor se desensibilizan; se observa en los registros de patch clamp primero muchas oscilaciones y luego cierre por un tiempo prolongado.
~ La oscilacion de cierres de apertura vienen de un solo canal y permite obtener medidas de la cinetica del canal que son imprtantes para su caracterización.
~Hay distintas configuraciones de patch clamp, otra es el "whole-cell" patch clamp, donde se rompe la membrana de la célula para analizar más de un canal iónico a la vez.

Estos sistemas pueden medir corriente ya que logran "clampear" el voltaje.
*Voltage-Clamp: utiliza dos electrodos (uno de estímulo y uno de registro)
~Clampear el voltaje quiere decir que mantego el voltaje fijo. Si un canal abre y se produce una corriente, el volatje cambiaria. El sistema lo que hace es inyectar una corriente equivalente a la corriente producto de la apertura del canal. Esta corriente inyectada es la que se mide.
~Técnica utilizada para medir la corriente electrica; conductividad unitaria.
~ Nos permite determinar la apertura y el tipo de canal iónico en la membrana.
~Luego de haber logrado expresar los canales iónicos en un ovocito, se introduce el agonista al ambiente celular el cual abrirá todos los canales. Es aquí entonces cuando se expresa el voltaje constante de todos los canales
~Este analisis se utiliza mayormente para ver el efecto de las drogas en membranas neuronales y ver como cambia la corriente que pasa a traves de las mismas.

-Existen mas de 140 distintos canales de iones.

- Cada canal tiene unos parámetros bien fijos que nos permiten determinar su identidad.

-Es importante entender la estructura de un canal iónico para poder entender como cambia su "ACTIVE SITE"
  • si tenemos la estructura del lugar activo se pueden crear drogas para activar o inhibir los mismos.
-Tambien entendiendo la estructura se pueden disen~ar bloqueadores del poro.

-Se conoce más sobre la estructura de los canales de Potasio, que de los de Sodio. Existen 4 tipos de canales de Potasio:
  • Inward Rectifiers (pasan corriente de carga positiva más agilmente hacia el interior de la célula)
  • Calcium Activators (se abren en presencia de Calcio)
  • Tandem Pore Domain ("leak channels" pueden regulados por varios mecanismos inclyendo pH, tensión de oxígeno y proteínas G) - no dependen del voltaje.
  • Voltage Gated (canales que se abren o cierran de acuerdo con el voltaje transmembranal de la membrana en que se encuentran)

-Mc Kinnon se dedicó a expresar "voltage gated potassium channels" en levaduras
*utilizó anticuerpos -> en la estructura original de los canales de potasio salieron expresados los mismos
*se comienza a ver estructura de canales, luego de cristalizarlo.
*luego de tener la estructura de este tipo de canal de potasio resultó posible definir cómo es que funciona:
~El ión de potasio entra hidratado por el canal. El filtro de selectividad dentro del canal contiene carbonilos (-CO) cargados negativamente. Sodio no es desidratado por el grupo carbonilo, por lo tanto sodio no pasará por este filtro .
~Potasio logra pasar tan agilmente por el filtro gracias a la repulsión de cargas de los potasios luego de pasar por el grupo carbonilo.
  • ?Donde está el dominio que causa el "gating"?
~El encontrar este dominio resultó ser un poco complicado ya que en primera instancia los anticuerpos que habían interacionado con el canal alaron la estructura completa y entonces el dominio S4 no salía expresado fuera de la membrana. Ciertamente era el dominio S4 el responsable por el "gating" debido a cargas sentidas en el potencial de membrana que entonces llegaban al "voltage center" localizado en el S4.

CANALES DE SODIO

-No se conoce mucho sobre los canales de sodio, ya que su estructura no se ha logrado describir tan claramente con la de los canales de potasio. Sabemos que el canal de sodio es uno grande, complejo, e hidrofóbico.

-Este canal es importante por que esta envuelto en la generación de potencial de acción, problemas cardiácos y en efecto de drogas.

-Los canales de Sodio y de Potasio, juntos controlan el potencial de acción. Primero se abre el canal de sodio <dependiente de voltaje> luego que este se cierra el canal de potasio abre <repolarización>

Ligand-Gated Ion Channels

-No existe una estructura a alta resolución de estos canales.

-Pueden ser intra/extra-celulares

-iones pasan a favor de concentración

-En términos cinéticos movimiento de cargas tienen dependencia de voltaje.

-Estos canales estan envueltos en Alzheimers, adicción a nicotina, y Parkinsons.

- Para cada evento de contracción muscular, existen 5 canales envueltos en el mismo.

Canalopatía ("CHANELOPATÍAS")

-Mutaciones en distintas partes de los canales.

-Miastenia Gravia: enfermedad autoinmune donde se desarrollan anticuerpos contra receptores nicotínicos y los músculos se debilitan.

-Más de 100 enfermedades.

-Estas mutaciones producen canales rápidos/lentos
*Deficiencia de acetilcholinerasa
*Deficiencia de Rapsin

-Enfermedades han dado manera de ver como funcionan estas mutaciones "in-vivo"

-Síndrome miasténico de canal lento: cierre del canal (al hacer prueba de voltage clamp) es lento
*se pierde calcio
*miocitos (fibras) comienzan a morir

- Se ha encontrado que en mutacion alpha C418W al tomar estratina produce gran debilidad muscular <se le llama cholesterol sensitive>